陸小丹 劉 萍 唐望先

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院肝病研究所，武漢430000）

肝硬化是一種或多種因素導(dǎo)致的慢性進(jìn)展性肝病，早期出現(xiàn)肝細(xì)胞的廣泛變性壞死，而彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)形成則是其晚期最主要的病理改變。在我國以病毒性肝硬化為主，歐美國家以酒精性肝硬化為主。臨床上以肝功能損害和門靜脈高壓為主要表現(xiàn)，可出現(xiàn)多系統(tǒng)受累，如血液動力學(xué)障礙，肝硬化心肌癥，肝性腦病等。目前尚無有效地治療措施，近年來大麻素及其受體成為肝硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的研究熱點，為肝硬化藥物治療靶點提供新的思路。

1.大麻素及其受體概述

大麻作為藥物使用已經(jīng)有幾千年的歷史了，大麻含有多種活性成分，其中以△9－四氫大麻酚（△9－tetrahydrocannabind，△9-THC）為主。上世紀(jì)90年代初，發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)存在著一種酰胺、酯類和長鏈不飽和脂肪酸組成的新的脂質(zhì)介質(zhì)，與大麻的活性成分作用極其相似，稱為內(nèi)源性大麻素。主要包括兩種：N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）和2-花 生 四 烯 酶 甘 油 （2-arachidonoylglycerol，2-AG）。目前其它的內(nèi)源性大麻素類分子也已經(jīng)陸續(xù)被人 們 發(fā) 現(xiàn)：Noladin ether，Virodhamine，N-arachidonoyl dopamine，N-arachidonoyl-L-serine等。內(nèi)源性大麻素受體主要有兩種：大麻素受體－1（cannabinoid receptor 1，CB1）和 大 麻 素 受 體-2（cannabinoid receptor 2，CB2）。此外，還存在其他受體：辣椒素受體、過氧化物酶體增殖激活受體［1］。AEA與CB1的親和力要大于CB2，而2-AG與CB1和CB2的親和力相似［2］。CB1和CB2都是視紫紅質(zhì)樣家族的7次跨膜受體，7個跨膜螺旋相互作用形成的中央核心是其配體結(jié)合的核心部位［3］。細(xì)胞內(nèi)CB1和CB2依賴G蛋白的信號通路主要有：腺苷酸環(huán)化酶途徑、MAP蛋白激酶途徑、PI3激酶途徑和FAK途徑等。不依賴G蛋白的通路目前已經(jīng)確認(rèn)的有：激活鞘磷脂酶和誘導(dǎo)一氧化氮和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的合成。研究發(fā)現(xiàn)CB受體可以調(diào)節(jié)鈣離子和鉀離子通道的開放。此外，由于內(nèi)源性大麻素具有親脂性，可能不依賴受體而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［1］。CB1主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在脂肪組織和消化道等也有表達(dá)。CB2主要分布在免疫系統(tǒng)，在外周組織如睪丸等有少量表達(dá)［5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)CB1和CB2在正常肝臟有微弱表達(dá)或不表達(dá)，但是在酒精、肝炎病毒、膽管結(jié)扎和血吸蟲感染誘發(fā)的實驗性肝硬化模型中表達(dá)增加，主要表達(dá)在肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）和血管內(nèi)皮細(xì)胞［4－7］，且肝臟組織中 AEA 和2-AG 的表達(dá)水平明顯升高［9－11］。此外，有研究表明每天吸食大麻是丙型肝炎病人發(fā)展為肝纖維化的獨立預(yù)警因素［11］。上述研究提示大麻素及其受體在肝硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用。

2.大麻素及其受體激動劑和拮抗劑在肝纖維化中的作用

在肝硬化病人中，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)被激活，外周血AEA水平增高與肝功能受損的程度相關(guān)［12］。但也有研究表明，在發(fā)生肝硬化的病人外周血中AEA水平的升高與肝功能受損的程度無相關(guān)性［13］，肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSC）的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過稱中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而肝纖維化可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化。在肝硬化患者的 HSC和四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的HSC中，CB1受體表達(dá)明顯上調(diào)［6］。正常人肝臟中未檢測到CB2受體，而在激活的HSC的中可以檢測到CB2受體［5］。

通過敲除小鼠的CB1基因或選擇CB1選擇性拮抗劑利莫那班（rimonabant，SR141716）作用于小鼠，小鼠的纖維化程度和肝組織的轉(zhuǎn)化生長因子β水平明顯降低，MFB的增殖受到抑制甚至凋亡，其機(jī)制可能是通過降低PKB／AKT或ERK的磷酸化，進(jìn)而對細(xì)胞增殖的信號通路［14］造成影響。而敲除了CB2基因的小鼠與野生型小鼠相比，給予CCl4時更易發(fā)生肝纖維化［5］。當(dāng)用內(nèi)源性大麻素或CB2特異性的激動劑（如JWH-015）作用于體外培養(yǎng)的HSC時，能呈劑量依賴性的抑制HSC的增殖和促進(jìn)其凋亡，而分別用COX-2的抑制劑和抗氧化劑時能減弱這種效應(yīng)，推測其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)COX-2的合成，進(jìn)而抑制HSC的增殖，通過啟動細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激促進(jìn)其凋亡［15］。Javier Mu~noz-Luque等把CB2選擇性激動劑（JWH-133）注入肝硬化大鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，肝硬化大鼠肝臟組織的α－平滑肌蛋白、和Ⅰ型膠原減少，基質(zhì)金屬蛋白-2增加，肝纖維化程度也明顯減輕［15］。上述研究提示CB1選擇性拮抗劑和CB2選擇性激動劑可以做為抗肝纖維化藥物的研究靶點。

在體外研究表明，AEA能選擇性地使原代HSC壞死，而使用CB1和CB2的拮抗劑不能阻止這種效應(yīng)，提示AEA對HSC的這種作用不是由這兩類受體介導(dǎo)的。但在使用膽固醇耗竭劑甲基－β－環(huán)糊精后，可以有效地阻止AEA導(dǎo)致的HSC的壞死。由于HSC胞膜膽固醇含量豐富，推測可能與HSC胞膜的脂筏（富含膽固醇、鞘磷脂等脂質(zhì)）聚集有關(guān)，進(jìn)而激活胞膜的還原型輔酶Ⅱ氧化酶，使其磷酸化，進(jìn)而發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧化族，同時還可能與HSC胞內(nèi)Ca增加有關(guān)［16－17］。當(dāng)肝臟發(fā)生纖維化時，循環(huán)血中的AEA濃度增加可能是機(jī)體對纖維化的一個調(diào)節(jié)反應(yīng)［17－18］。由于AEA能導(dǎo)致HSC的壞死，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體的局部炎癥反應(yīng)，還可引起系統(tǒng)血管舒張，進(jìn)而導(dǎo)致有效循環(huán)血量減少，誘發(fā)腹水等。因此，AEA作為藥物治療肝硬化在臨床上的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

3.大麻素及其受體在肝硬化并發(fā)癥中的作用

3.1 血液動力學(xué)

肝硬化晚期，肝小葉重建和再生結(jié)節(jié)形成使門靜脈系統(tǒng)阻力增加和門靜脈血流增多，這是門靜脈高壓發(fā)生的主要機(jī)制。內(nèi)臟血管舒張導(dǎo)致高動力循環(huán)、低血壓和腸系膜充血，進(jìn)一步加劇了門靜脈高壓。越來越多的研究表明在大部分動物模型中，THC、AEA和2-AG能引起長期的低血壓和心動過緩［19－22］。此外，AEA 還能 引起腸 系膜動 脈舒張，可被SR141716所阻斷，而其他的CB1拮抗劑則無此作用［21］。Batkai S等發(fā)現(xiàn)從肝硬化大鼠和病人體內(nèi)分離的單核細(xì)胞內(nèi)的AEA的濃度較正常對照組明顯升高，而加用SR141716后，血液動力學(xué)狀態(tài)顯著改善，動脈血壓升高，腸系膜血流量和門靜脈壓降低［9］。提示其機(jī)制可能是粘附在血管內(nèi)皮組織的單核細(xì)胞和血小板通過旁分泌AEA，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的CB1受體，激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增強(qiáng)舒血管因子的基因轉(zhuǎn)錄。此外，還可能與高表達(dá)CB1的血管內(nèi)皮細(xì)胞對舒血管因子的敏感性增加有關(guān)。內(nèi)源性大麻素引起血管舒張也可不依賴CB受體機(jī)制，Milman等發(fā)現(xiàn)花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA）能產(chǎn)生內(nèi)皮組織依賴的血管舒張，不能被SR141716和CB2選擇性拮抗劑SR144528阻斷，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ARA與CB2不結(jié)合，與CB1的親和力也很弱［23］。

3.2 肝硬化心肌癥

大多數(shù)肝硬化患者心肌收縮力呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)基線，但基礎(chǔ)心輸出量在不同程度上有所增加，血管壓力反應(yīng)下降，導(dǎo)致基礎(chǔ)心輸出量增加、外周血管阻力下降、動脈壓下降、心室的舒張性和（或）收縮性減弱等一系列改變，此時被稱為肝硬化性心肌?。╟irrhotic cardiomyopathy，CCM）［24］。Batkai S 等 發(fā)現(xiàn)肝硬化患者心肌組織和正常人心肌組織中CB1的表達(dá)水平相似，但是前者心肌組織中AEA的水平明顯高于后者，將CB1選擇性受體拮抗劑AM251靜脈推注入肝硬化小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，肝硬化小鼠的心肌收縮力增加，低血壓和心動過速的癥狀明顯改善，推測肝硬化心肌癥的發(fā)生可能與心肌中的AEA升高有關(guān)［25］。而這一研究結(jié)果與 Bonz A［26］等的研究一致。Gaskari SA等也發(fā)現(xiàn)心動過速－應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致心肌釋放的內(nèi)源性大麻素增加［27］。上述研究提示AEA通過G蛋白依賴性CB1反應(yīng)通路使得內(nèi)源性大麻素的局部神經(jīng)元產(chǎn)物增加，促進(jìn)了CCM的發(fā)生發(fā)展。

3.3 肝性腦病

肝性腦病是肝硬化最嚴(yán)重的并發(fā)癥和最常見的死亡原因，主要臨床表現(xiàn)是意識障礙、行為失常和昏迷［28］。Avraham Y和Dagon等發(fā)現(xiàn)在硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝衰竭大鼠腦中的CB2受體及其配體2-AG升高［29－30］，注 射 非 選 擇 性 CB1／CB2 激 動 劑、△9-THC［30］、2-AG、SR141716 或 CB2 選 擇 性 激 動 劑HU-308［29］后，大鼠肝性腦病的癥狀明顯改善。其中△9-THC的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)與肝功能的改善無關(guān)，且在CB2基因敲除的小鼠上未見明顯的保護(hù)作用。表明這種神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)來自于△9-THC與大腦中CB2的直接作用，進(jìn)而激活A(yù)MP關(guān)聯(lián)的蛋白激酶，在調(diào)節(jié)能量平衡的同時，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元生成與凋亡來控制大腦的認(rèn)知功能［30］。上述研究提示CB2可能成為肝性腦病具有保護(hù)作用的新靶點，然而CB1和CB2在肝性腦病發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究［31］。

4.待 解決的問題及臨床應(yīng)用前景

雖然關(guān)于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在肝纖維化中的作用的證據(jù)越來越多，但是人們對于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)作用的細(xì)胞靶點和的分子機(jī)制的了解還有相當(dāng)長的距離。是否存在一種尚未發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性大麻素介導(dǎo)的CB1依賴的促纖維化作用，或是否CB1的促肝纖維化不依賴配體的結(jié)合，是目前需要解決的問題，此外，還需進(jìn)一步確認(rèn)CB2依賴的抗炎效應(yīng)在肝纖維化中的作用和體內(nèi)內(nèi)源性大麻素介導(dǎo)的纖維生成細(xì)胞凋亡能力。制造和繁殖內(nèi)源性大麻素相關(guān)的某些細(xì)胞特異性成分缺失的小鼠有助于解決上述部分問題［32］。

目前內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)臨床應(yīng)用主要集中在肥胖、代謝綜合征、疼痛、心血管疾病、糖尿病、帕金森病、酗酒、多發(fā)性硬化病等［33］。關(guān)于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在臨床上治療肝硬化的數(shù)據(jù)有限，而且目前的研究結(jié)果均來源于動物和體外培養(yǎng)的細(xì)胞，藥物方面主要集中在CB1拮抗劑和CB2激動劑。CB1選擇性拮抗劑利莫那班已經(jīng)被批準(zhǔn)用于肥胖和非酒精性脂肪性肝炎的治療。但近年來，發(fā)現(xiàn)在因不良反應(yīng)而中止利莫那班臨床試驗的患者中，約有一半歸因于神經(jīng)精神效應(yīng)，如情緒壓抑、焦慮、情緒激動和睡眠障礙，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，與CB1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布密切相關(guān)［34］。利莫那班用于抗小鼠肝纖維化的劑量是用于治療肥胖病人劑量的20倍，如果用于治療肝纖維化時，神經(jīng)精神效應(yīng)的發(fā)生幾率就會相應(yīng)升高［32］。因此，在利用CB1選擇性拮抗劑治療肝硬化之前，關(guān)于CB1拮抗劑安全性方面的調(diào)查結(jié)果需要慎重考慮?？傊?，內(nèi)源性大麻素及其受體在肝纖維化的治療方面帶來了新的希望。

［1］A Mallat，S Lotersztajn.Endocannabinoids and liver Disease.I.Endocannabinoids and their receptors in the liver.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294（1）：G9-G12

［2］Lotersztajn S，Teixeira-Clerc F，Julien B，et al.CB2receptors as new therapeutic targets during liver diseases.Br J Pharmacol.British Journal of Pharmacology，2008，153（2）：286-289

［3］Di Marzo V，Bifulco M，De Petrocellis L.The endocannabinoid system and its therapeutic exploitation，Nature Rev，2004，3（9）：771-3784

［4］Kunos G，Osei-Hyiaman D，Liu J，et al.Endocannabinoids and the control of energy homeostasis.J Biol Chem，2008，283（48）：33021-33025

［5］Julien B，Grenard P，Teixeira-Clerc F，et al.Antifibrogenic role of the cannabinoid receptor CB2in the liver.Gastroenterology，2005，128（3）：742-755

［6］Liu HY，Gao X，Duan RX，et al.Endocannabinoids anandamide and its cannabinold receptors in liver fibrosis after murine schistosomiasis.J Huazhong Univ Sci Technology Med Sci，2009，29（2）：182-186

［7］Sugiura T，Kishimoto S，Oka S，et al.Biochemistry pharmacology and physiology of 2-arachidonoylglycerol，an endogenous cannabinoid receptor ligand.Prog Lipid Res，2006，45（5）：405-446

［8］Teixeira-Clerc F，Julien B，Grenard P，et al.CB1cannabinoid receptor antagonism：a newstrategy for the treatment of liver fibrosis.Nat Med，2006，12（6）：671-676

［9］Batkai S，Jarai Z，Wagner JA，et al.Endocannabinoids acting at vascular CB1receptors mediate the vasodilated state in advanced liver cirrhosis.Nat Med，2001，7（7）：7827-7832

［10］Siegmund SV，Qian T，De Minicis S，et al.The endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol induces death of hepatic stellate cells via mitochondrial reactive oxygen species.FASEB J，2007，21（11）：2798-2806

［11］Hezode C，Roudot-Thoraval F，Nguyen S，et al.Daily cannabis smoking as a risk factor for fibrosis progression in chronic hepatitis C.Hepatology，2005，42（1）：63-71

［12］Caraceni P，Viola A，Piscitelli F，et al.Circulating and hepatic endocannabinoids and endocannabinoid-related molecules in patients with cirrhosis.Liver Int，2010，30（6）：816-825

［13］Tam J，Liu J，Mukhopadhyay B，et al.Endocannabinoids in Liver Disease.Hepatology，2011，53（1）：346-355

［14］Anna Parfieniuk，Robert Flisiak.Role of cannabinoids in chronic liver diseases.World J Gastroenterol，2008，14（40）：6109-6114

［15］Javier Mu~noz-Luque，Josefa Ros，Guillermo Fernández-Varo，et al.Regression of Fibrosis after Chronic Stimulation of Cannabinoid CB2Receptor in Cirrhotic Rats.J Pharmacol Exp Ther，2008，324（2）：475-483

［16］Yang Q，Liu HY，Zhang YW，et al.Anandamide induce cell death through lipid rafts in hepatic stellate cells.J Gastroenterol Hepatol，2010，25（5）：991-1001

［17］Siegmund SV，Uchinami H，Osawa Y，et al.Anandamide induces necrosis in primary hepatic stellate cells.Hepatology，2005，41（5）：1085-1095

［18］Fernandez-Rodriguez CM，Romero J，Petros TJ，et al.Circulating endogenous cannabinoid anandamide and portal，systemic and renal hemodynamics in cirrhosis.Liver Int，2004，24（5）：477-483

［19］Benowitz NL，Jones RT.Cardiovascular effects of prolonged delta-9-tetrahydrocannabinol ingestion. Clin Pharmacol Ther，1975，18（3）：287-297

［20］Varga K，Lake K，Martin BR，et al.Novel antagonist implicates the CB1cannabinoid receptor in the hypotensive action of anandamide.Eur J Pharmacol，1995，278（3）：270-283

［21］Jarai Z，Wagner JA，Goparaju SK，et al.Cardiovascular effects of 2-arachidonoyl glycerol in anesthetized mice.Hypertension，2000，35（2）：679-684

［22］Cohen C，Perrault G，Voltz C，et al.Soubrie P.SR141716，a central cannabinoid CB1receptor antagonist，blocks the motivational and dopamine-releasing effects of nicotine in rats.Behav Pharmacol，2002，13（5-6）：451-463

［23］Milman G，Maor Y，Abu-Lafi S，et al.N-arachidonoyl L-serine，an endocannabinoid-like brain constituent with vasodilatory properties.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（7）：2428-2433

［24］MandellMS，Tsou MY.Cardiovascu lar dysfunction in patients with End-stage liver disease.J Chin Med Assoc，2008，71（7）：331-335

［25］Batkai S，Mukhopadhyay P，Harvey-White J，et al.Endocannabinoids acting at CB1receptors mediate the cardiac contractile dysfunction in vivo in cirrhotic rats.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293（3）：H1689-H1695

［26］Bonz A，Laser M，Kullmer S，et al.Cannabinoids acting on CB1receptors decrease contractile performance in human atrial muscle.J Cardiovasc Pharmacol，2003，41（4）：657-664

［27］GaskariSA，Liu H，Moezi L，et al.Role of endocannabinoids in the pathogenes is of cirrhotic cardiomyopathy in bile duct ligated rats.Br J Pharmaco，2005，146（3）：315-323

［28］白啟軒，賈繼東.肝性腦病的研究進(jìn)展?，F(xiàn)代消化及介入診療，2009，14（1）：29-32

［29］Avraham Y，Israeli E，Gabbay E，et al.Endocannabinoids affect neurological and cognitive function in thioacetamide-induced hepatic encephalopathy in mice.Neurobiol Dis，2006，21（1）：237-245

［30］Dagon Y，Avraham Y，Ilan Y，et al.Cannabinoids ameliorate cerebral dysfunction following liver failure via AMP-activated protein kinase.FASEB J，2007，21（10）：2431-2441

［31］Lotersztajn S，Teixeira-Clerc F，Julien B.CB2receptors as new therapeutic targets for liver diseases.British Journal of Pharmacology ，2008，153（20）：286-289

［32］Siegmund SV，Schwabe RF.Endocannabinoids and Liver Disease.II.Endocannabinoids in the pathogenesis and treatment of liver fibrosis.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294（2）：G357-G362

［33］Muccioli GG.Blocking the cannabinoid receptors：drug candidates and therapeutic promises.Chem Biodivers，2007，4（8）：1805-1827

［34］原野，吳純啟，廖明陽.利莫那班的藥理學(xué)研究進(jìn)展。中國新藥雜志，2009，5（21）：399-402