犬細(xì)小病毒病診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了犬細(xì)小病毒病的臨床檢查、血凝與血凝抑制試驗(yàn)、PCR檢測(cè)的操作方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于犬細(xì)小病毒病的鑒定及其流行學(xué)調(diào)查、診斷和監(jiān)測(cè)。其中病毒分離、血凝與血凝抑制試驗(yàn)、PCR檢測(cè)適用于犬細(xì)小病毒的病原診斷。

2 試劑和材料

2.1 FK81細(xì)胞（貓腎細(xì)胞）。

2.2 0.9%生理鹽水。

2.3 1%豬紅細(xì)胞液。

2.4 犬細(xì)小病毒陽(yáng)性血清。

2.5 96孔“v”形微量反應(yīng)板。

2.6 Taq酶及10倍Taq酶反應(yīng)緩沖液：Taq酶濃度為5U/μL，-20℃保存。

2.7 1.5mL Eppendorf管。

2.8 0.2mL PCR薄壁管。

2.9 dNTP: 含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存。

2.10 引物：濃度為20μmol/L，其序列如下：

上游引物（CPVF）：5’GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC3’；

下游引物（CPVR）：5’GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C3’。

2.11 10%十二烷基硫酸鈉：配制參見(jiàn)附錄A。

2.12 蛋白酶K貯備液。

2.13 5×TBE電泳緩沖液。

3 器材和設(shè)備

3.1 PCR儀。

3.2 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至4℃、離心速度可達(dá)12000g以上。

3.3 水平電泳儀。

3.4 凝膠成像系統(tǒng)。

4 臨床檢查

4.1 臨床特征

4.1.1 潛伏期1周到2周，病初無(wú)任何癥狀，食欲減退或廢絕，體溫40℃以上，粉紅色黏稠血樣物。

4.1.2 病犬先出現(xiàn)嘔吐，嘔吐出白色泡沫或黃色液體，繼而腹瀉，糞便稀薄而惡臭，劇烈的腹瀉呈噴射狀，糞便呈紅色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁樣稀便，并有特殊的腥臭味。

4.1.3 患犬迅速消瘦，倦臥不起，目光呆滯，眼窩下陷，腹圍緊縮，機(jī)體脫水，皮膚干燥、彈性降低。

4.2 病理變化

4.2.1 心臟腫大呈灰黃色，切面外翻，質(zhì)地松軟，心肌有出血性斑紋。

4.2.2 肝臟腫大，包膜緊張，多呈黃褐色，質(zhì)地松軟有局灶性壞死，斷面有豆蔻狀花紋。

4.2.3 胃空虛，黏膜輕度潮紅，附有大量黏液；小腸壁增厚，腸管變粗，腸腔狹窄，形成厚層黏膜皺褶，易于剝落，腸腔內(nèi)充滿紫紅色粥樣內(nèi)容物并混有血凝塊。

4.3 判定

若臨床癥狀符合4.1.1或4.1.2且出現(xiàn)4.2.1或4.2.3的病理變化，則可判定疑似犬細(xì)小病毒病，其他臨床癥狀和病理變化可作為參考指標(biāo)；疑似病例可采用血凝與血凝抑制試驗(yàn)或PCR檢測(cè)進(jìn)行確診。

5 血凝與血凝抑制試驗(yàn)

5.1 血凝試驗(yàn)（HA）的操作方法

5.1.1 樣品采集活犬的淚液、鼻液、糞便，病死犬的肝、脾、肺等組織器官。將待檢組織或糞便樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000g離心15min，收集上清液待檢；口腔拭子、糞拭子用少量生理鹽水浸潤(rùn)后，取上清液待檢。

5.1.2 在96孔“v”形微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50μL理鹽水。

5.1.3 于左側(cè)第1孔加50μL待檢樣品混合均后，吸50μL至第2孔，混合均勻后，吸50μL至第3孔，依次倍比稀釋?zhuān)恋?1孔，吸棄50μL，稀釋后病毒稀釋度為第1孔1∶2，第2孔1∶4，第3孔1∶8……最后12孔為對(duì)照。

5.1.4 由左至右依次向各孔加1%豬紅細(xì)胞懸液50μL置微型混合器上振蕩，使血球與病毒充分混合，在37℃溫箱中作用15min~30min后，待對(duì)照紅細(xì)胞已沉淀可觀察結(jié)果。

5.1.5 判定結(jié)果：以100%凝集（血球呈顆粒性傘狀凝集沉于孔底）的病毒最大長(zhǎng)稀釋孔為該病毒血凝價(jià)，即一個(gè)凝集單位，不凝集者紅細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀。

5.2 血凝抑制試驗(yàn)（HI）的操作方法

5.2.1 根據(jù)HA試驗(yàn)結(jié)果，確定病毒的血凝價(jià)，配成4個(gè)血凝單位病毒溶液。

5.2.2 在96“v”形微量板上進(jìn)行，用固定病毒稀釋血清法，自第1孔至第10孔各加50μL生理鹽水，11和12孔分別為4單位CPV細(xì)胞病毒培養(yǎng)液和抗犬細(xì)小病毒陽(yáng)性血清對(duì)照。

5.2.3 第1孔加犬細(xì)小病毒陽(yáng)性血清50μL，混合均勻，吸50μL至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50μL，如此稀釋后血清濃度為第1孔1：2，第2孔1：4，第3孔1：8……

5.2.4 由第1孔至11孔各加50μL，4單位待測(cè)病毒液，第12孔50μL血清，混合均勻，置37℃溫箱再作用15min~30min，待4單位病毒已凝集紅細(xì)胞可觀察結(jié)果。

5.2.5 判定結(jié)果：被已知犬細(xì)小病毒陽(yáng)性血清抑制血凝者，該病毒為犬細(xì)小病毒。

6 PCR檢測(cè)

6.1 病料的采集及處理

采集的樣品包括犬的淚液、鼻液、唾液、糞便及病死犬的肝、脾、肺等組織器官。將待檢組織或糞便樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000g離心15min，收集上清液待檢?？谇皇米?、糞拭子用少量生理鹽水浸潤(rùn)后，取上清液待檢。經(jīng)細(xì)胞病原分離培養(yǎng)的樣品，收集細(xì)胞沉淀待檢。CPV陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品的同樣處理。

6.2 DNA抽提

取上清液465μL，加入25μL 10%十二烷基硫酸鈉和10μL的20mg/mL蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2h；加入等量的飽和酚溶液500μL，振蕩混勻20s，12000g離心5min，取上清液；加入等量的酚：三氯甲烷：異戊醇（25：24：1）， 振 蕩混勻 20s，12000g離心5min，取上清液；再加入等量的三氯甲烷：異戊醇（24：1），振蕩混勻20s，12000g離心5min，取上清液；最后加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻，12000g離心10min，棄上清，室溫干燥后，加入50μL雙蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，-20℃貯存?zhèn)溆谩PV陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品與待檢樣品同步進(jìn)行樣品處理，并進(jìn)行DNA抽提。另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提試劑盒進(jìn)行。

6.3 PCR檢測(cè)

在0.2mLPCR薄壁管中，按每個(gè)樣品10倍Taq酶濃縮緩沖液2.5μL、dNTP0.5μL、Taq 酶 0.5μL、DNA模板2μL、上游引物和下游引物（CPVE、CPVR）各 0.5μL、三蒸水18.5μL，配制PCR檢測(cè)體系。將PCR管置PCR儀上按如下程序擴(kuò)增：首先94℃變性2min；再94℃、30s，55℃、30s，72℃、40s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃、3min。用TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖平板（含 0.5μg/mLEB），將平板放入水平電泳儀，使電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)膠面，將10μLPCR產(chǎn)物和2μL加樣緩沖液（6X），混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對(duì)照。5V/cm電泳約30min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

6.4 結(jié)果判定

6.4.1 經(jīng)PCR檢測(cè)，CPV陽(yáng)性對(duì)照樣品可擴(kuò)增出大小為609bp的核酸片段，且陰性對(duì)照樣品無(wú)擴(kuò)增條帶，否則試驗(yàn)結(jié)果視為無(wú)效。

6.4.2 在符合6.4.1的條件下，若待檢樣品擴(kuò)增出了大小為609bp的核酸片段，則初步判定犬細(xì)小病毒核酸陽(yáng)性；若待檢樣品無(wú)擴(kuò)增條帶或擴(kuò)增條帶大小不為609bp，則判定犬細(xì)小病毒核酸陰性。

6.4.3 待檢樣品擴(kuò)增出的陽(yáng)性基因片段應(yīng)進(jìn)行核酸序列測(cè)定，若其序列與提供的比對(duì)序列的同源性大于等于90%，則可確診為犬細(xì)小病毒核酸陽(yáng)性，否則判定犬細(xì)小病毒核酸陰性。

6.4.4 若犬細(xì)小病毒核酸陽(yáng)性且病原分離也呈陽(yáng)性，則可判定犬細(xì)小病毒感染陽(yáng)性。