任海英，李 彤

（1.河南省衛(wèi)輝市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，河南 衛(wèi)輝453100；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河南 鄭州450002）

1 引言

昆蟲經(jīng)過約3億8千萬年的演化，已經(jīng)發(fā)展成為地球上種類繁多、數(shù)量巨大、分布廣泛的動物類群之一。目前，已經(jīng)定名的昆蟲約有100多萬種，占已知動物數(shù)量的2／3，但據(jù)不完全統(tǒng)計全世界仍約有90%的昆蟲是還未定名的［1］。

傳統(tǒng)的昆蟲分類研究是通過觀察、對比昆蟲的外部形態(tài)特征，尋找昆蟲間的差異，從而達(dá)到分類鑒定的目的。昆蟲中常用的分類特征有翅脈、口器、觸角、生殖器、足及其跗節(jié)等。這些分類特征在高級分類單元中可以很好地反映物種的分類地位，但在小的分類單元，如屬、族、種內(nèi)則不容易確定物種的分類地位，再到種群、生態(tài)型則更難確定分類地位。為此，必須尋找更細(xì)的形態(tài)特征，如某些部位毛片的形態(tài)、分布等，但這些特征又容易受非遺傳穩(wěn)定性的影響，而導(dǎo)致錯誤的結(jié)果［2］。傳統(tǒng)的昆蟲分類一方面具有直觀、簡單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，另一方面它又受制約于研究人員的主觀意識，需要研究人員具有豐富的分類經(jīng)驗，而一個好的分類人員往往需要多年的培養(yǎng)。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與各個學(xué)科的交叉滲透，已有200多年歷史的昆蟲分類學(xué)也獲得了極大的發(fā)展。20世紀(jì)80年代以來，結(jié)合遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)背景的分類學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到昆蟲的分類研究中［3，4］。本文針對分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲分類上的應(yīng)用與發(fā)展進(jìn)行闡述，對其在植保部門中的應(yīng)用前景進(jìn)行了分析。

2 昆蟲分子生物學(xué)分類技術(shù)和方法

2.1 分子雜交技術(shù)

分子雜交技術(shù)（Molecular hybridization）是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，包括Southern分子雜交技術(shù)、Northern分子雜交技術(shù)和原位雜交技術(shù)。其基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈分子，在一定的條件下可按堿基互補(bǔ)原則，通過退火形成雙鏈，在高度嚴(yán)格的實驗條件下，不同種的核酸僅在互配的序列上配對，具有高度的特異性。Collins（1987）和牛玲玲等（1992）使用DNA探針雜交方法在雙翅目按蚊屬的類群中進(jìn)行了分類研究［5，6］。分子雜交的好與壞，關(guān)鍵在于探針的選擇，下面簡述DNA探針的篩選方法：

（1）使用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行酶切反應(yīng)，根據(jù)酶切片段的多態(tài)性，選擇并回收合適的DNA片段，使用同位素將其標(biāo)記為特異性的探針［6，7］。

（2）通過酶切、克隆的方法構(gòu)建相應(yīng)物種的基因文庫，將其近緣物種的總DNA標(biāo)記為探針，在基因文庫中進(jìn)行雜交，從中篩選出該物種特有的基因片段，標(biāo)記為探針。

（3）根據(jù)核糖體基因的多態(tài)性，從基因文庫中直接篩選核糖體基因探針。雖然雜交技術(shù)用于昆蟲鑒定具有高度的特異性、精確性和敏感性［8］，但也有學(xué)者提出DNA探針的“種的特異性”有一定的適用范圍［9］。另外，DNA探針的制備與使用總體費(fèi)用較高，操作技術(shù)比較繁瑣，并且同位素對人體具有一定的危害，這也制約了分子雜交技術(shù)在昆蟲分類中的進(jìn)一步推廣與發(fā)展。

2.2 基因片段的體外擴(kuò)增技術(shù)

1985年Kary Mullis等創(chuàng)建特異DNA片段的體外擴(kuò)增的技術(shù)，主要是利用聚合酶依賴于DNA模板的特性，模仿體內(nèi)的復(fù)制過程，在一對引物之間誘發(fā)聚合酶反應(yīng)，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行。因此，該技術(shù)被命名為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）。PCR的意義和影響甚至比限制性內(nèi)切酶等更為深遠(yuǎn)，是分子生物學(xué)領(lǐng)域的一次創(chuàng)舉，在一定程度上替代了傳統(tǒng)的DNA克隆方法［10］。Kary Mullis也因此獲得了1993的諾貝爾化學(xué)獎。就PCR循環(huán)條件來說，一般30～35個循環(huán)足以得到目的產(chǎn)物，其中退火溫度的選擇至關(guān)重要，原則上退火溫度過低，會造成非特異性產(chǎn)物量增加，過高則會無擴(kuò)增產(chǎn)物。在PCR基礎(chǔ)上，又迅速發(fā)展起來了一系列DNA多態(tài)檢測技術(shù)，如RFLP、RAPD、SSCP等，并很快被用于多種生物的物種鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化等的研究中。樸美花等（2002）用PCR技術(shù)對采于1980年和1987年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本進(jìn)行基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增均獲得成功［11］。Nielsen等（1999）利用形態(tài)學(xué)和以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的線粒體分型技術(shù)來識別非洲化蜜蜂，成功區(qū)別了來自4個種族的母系后代［12］。

2.3 RFLP技術(shù)

RFLP技術(shù)（限制性片段長度多態(tài)性分析，Restriction fragment length polymorphism）是基于不同的個體在等位基因上存在著堿基組成的差異，通過限制性內(nèi)切酶識別特異的酶切位點(diǎn)，將這些堿基差異反映在酶切片段的大小和組成上，從而達(dá)到區(qū)分的目的。目前，RFLP技術(shù)一般和PCR技術(shù)一起使用。在使用RFLP技術(shù)鑒定物種時，若需鑒別的物種具有較小的基因組或目的基因序列較短，其酶切片段的多態(tài)性直接可以通過跑聚丙烯酰胺膠或瓊脂糖凝膠進(jìn)行觀察；但對于大分子DNA來說，其鑒定還需和DNA雜交技術(shù)相結(jié)合。喬傳令等（1996）對庫蚊的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）進(jìn)行實驗研究，結(jié)果表明不同地理種群都有相同的單基因擴(kuò)增，但擴(kuò)增水平上有較大差異［13］。龍漫遠(yuǎn)（1993）針對線粒體DNA進(jìn)行了相應(yīng)的RFLP研究，得到了其相應(yīng)的酶切圖譜和片段多態(tài)性［14］。趙惠燕等（1997）利用同樣的方法在同翅目昆蟲中進(jìn)行了分類研究［15］。應(yīng)用RFLP分析方法，使傳統(tǒng)的昆蟲分類和區(qū)系進(jìn)化研究有了新的發(fā)展和飛躍，并且解決了一些利用傳統(tǒng)分類方法不能解決的問題。

2.4 RAPD技術(shù)

RAPD技術(shù)（隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析，Random amplified ploymorphic DNA）是1990年由 Willioms和Welsh兩個研究小組同時發(fā)展起來的一項分子多態(tài)性檢測技術(shù)。RAPD標(biāo)記的產(chǎn)生是基于一種可能性，即一段與某一單一引物RAPD（一般用10聚體引物）同源的DNA序列［16］，有可能在DNA模板另一條鏈上的不同位置上出現(xiàn)，這些位置之間的距離又處于通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的長度范圍。因此，當(dāng)條件滿足時，單個寡核苷酸引物就可以在PCR反應(yīng)中介導(dǎo)DNA呈幾何級數(shù)擴(kuò)增。經(jīng)RAPD檢測，大多表現(xiàn)為某一個擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)或消失，這意味著RAPD通?？捎米黠@性標(biāo)記［17］。通過對RAPD的結(jié)果分析和相應(yīng)序列的測序，可以篩選出針對于某一種群、生物型或物種的特有片段，并根據(jù)其序列設(shè)計特異引物，達(dá)到特異性檢測的目的，從而延伸出了一種更加特異的檢測技術(shù)——特征序列擴(kuò)增區(qū)域（sequence characterized amplified region，SCAR）。RAPD技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用在蚊蟲的分子系統(tǒng)學(xué)研究中［18～20］。蘇松坤等（2002）利用 RAPD分子遺傳標(biāo)記，篩選出了5種引物，這些引物所擴(kuò)增的RAPD標(biāo)記可作為鑒別歐洲蜜蜂和非洲蜜蜂的分子標(biāo)記［21］。

2.5 SSCP和DSCP技術(shù)

SSCP方法（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，Single－strand conformational polymorphism）和DSCP方法（雙鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，Double－strand conformational polymorphism）的基本原理相似，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某一特定的DNA片段，在高溫下使雙鏈DNA變性為單鏈DNA（ssDNA），然后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，ssDNA帶在凝膠中位置的差異反映了DNA序列的差異。

2.6 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼（DNA Barcoding）是由加拿大生物學(xué)家Paul Hebert等提出的生物快速鑒定的概念［22］，是通過在不同的生物類群中選擇合適的基因片段，針對基因片段的序列進(jìn)行分析，將物種的差異反映在基因序列上，從而達(dá)到區(qū)分物種的目的，類似于超市中分類貨物所使用的條形碼。目前全世界生物共有1580920條已公布的Barcoding序列信息，其中昆蟲有1036188條，詳見DNA 條形碼網(wǎng)站（http：／／www.boldsystems.org／views／login.php）。昆蟲DNA條形碼鑒定中選擇的基因是線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（COI），其具有穩(wěn)定、易擴(kuò)增、變異速率適中等優(yōu)點(diǎn)。DNA條形碼鑒定物種的操作步驟如下。

（1）使用通用引物在待測樣品DNA中進(jìn)行基因擴(kuò)增；

（2）測序得到相關(guān)序列；

（3）將序列提交網(wǎng)站和數(shù)據(jù)庫已有序列進(jìn)行比對；

（4）網(wǎng)站根據(jù)比對結(jié)果，給出樣品最相似的物種信息。

我國作為DNA條形碼國際組織中的一個重要節(jié)點(diǎn)，大量的相關(guān)研究工作正在開展。

3 昆蟲分子生物學(xué)鑒定技術(shù)在植物保護(hù)中的應(yīng)用

植物保護(hù)是針對于田間作物病蟲害預(yù)警與防治的一門科學(xué)，是我國糧食生產(chǎn)安全的重要保障。據(jù)不完全統(tǒng)計現(xiàn)在全國共有縣級以上植保技術(shù)推廣和管理機(jī)構(gòu)2905個，其中地、市、縣級2342個，鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）級綜合性農(nóng)技服務(wù)的農(nóng)技站30000余個，其中基層植保部門在病蟲害的預(yù)警與相關(guān)防治方法的推廣上扮演著重要的角色。害蟲防治一直是植保工作中的重要一環(huán)，但要做到防治，首先要學(xué)會識別。因此，昆蟲分類對于更好地開展植保工作也是必須的。目前，由于多種原因，在基層植保部門中，往往缺少具有昆蟲分類知識的高級技術(shù)人才。

傳統(tǒng)的分類學(xué)技術(shù)具有直觀、簡單、快捷、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，并且歷史悠久，形成了一套相對成熟的分類系統(tǒng)，但是這種方法依賴經(jīng)驗的積累，需要較長時間的系統(tǒng)學(xué)習(xí)才能掌握，而且其擴(kuò)展性不強(qiáng)，也就是說某個昆蟲類群的分類專家并不能完成其他類群的分類鑒定。而現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)則具有準(zhǔn)確、客觀、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，能夠鑒定出形態(tài)學(xué)不能區(qū)分的昆蟲親緣種，正好彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)方法的不足，而且其操作性更強(qiáng)，不需要掌握大量的分類知識，僅僅需要相關(guān)的分子生物學(xué)知識，就能在多個類群中開展。另外，現(xiàn)在分子生物的儀器、試劑和測序費(fèi)用大幅降低，也使得在基層植保部門當(dāng)中適當(dāng)開展相應(yīng)的分子生物學(xué)昆蟲鑒定成為可能。

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