李 寧，張義龍，李淑英，李志懷

（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨外一科，河北 承德 067000）

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷后常導致嚴重的膝關節(jié)不穩(wěn)，從而引起繼發(fā)的半月板和關節(jié)軟骨的損傷，為恢復膝關節(jié)的正常結構和功能，常需要手術行ACL重建術。在移植物的選擇方面，腘繩肌腱近年來應用較多，主要是因為四股腘繩肌腱強度較高，取材部位創(chuàng)傷小，術后恢復快［1］。但是，移植肌腱在骨道中的愈合屬于腱－骨愈合，相對于骨－骨界面愈合，其愈合時間較長［2］，限制了患者早期的康復練習。如何促進腱－骨愈合成為近年來學者們關注的一個焦點。本實驗的目的是通過在骨道中注入自體骨髓單個核細胞，以促進腱－骨界面愈合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 24只新西蘭大白兔（由承德醫(yī)學院實驗動物中心提供），體質量2.0～2.5kg，平均2.26kg。實驗前檢測雙側膝關節(jié)未見畸形，前后抽屜試驗及側方應力試驗均陰性。雙側膝關節(jié)均接受手術，隨機選取一側膝關節(jié)作為實驗側，對側作為對照側。

1.1.2 醫(yī)用耳腦膠 醫(yī)用耳腦膠為廣州白云醫(yī)用膠有限公司生產(chǎn)，固化時間小于15s，聚合熱低，局部刺激小，體表應用固化膜脫落為7～10d，體內(nèi)約4周可降解為水溶性物隨代謝排出體外。

1.2 方法

1.2.1 自體骨髓單個核細胞的獲得 經(jīng)耳緣靜脈注射3%的戊巴比妥鈉溶液（1mL／kg）將動物麻醉，雙側髂骨部消毒，用含有0.5mL肝素的10mL注射器，從雙側髂骨快速抽取骨髓各5mL，放入無菌離心管，1500r／min離心15min，取中間細胞層移入另一管內(nèi)，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）后再次1500r／min離心10min，棄上清，保留沉淀部分，再加入0.5mL PBS液吹打成單核細胞懸液，備用。

1.2.2 實驗動物模型的建立 在麻醉狀態(tài)下，雙膝術區(qū)備皮、消毒，取髕腱內(nèi)側縱行切口，于脛骨結節(jié)內(nèi)后、大腿內(nèi)側，分離出半腱肌腱，保留遠端止點完整，自腱和肌腹交界處近端切斷，肌腱斷端用4－0的肌腱編織線編織作為牽引線；于半腱肌腱遠端止點處鑿取5.0mm×3.5mm×3.5mm大小骨塊連同半腱肌腱共同切下做成肌腱－骨塊復合體備用。沿髕腱內(nèi)側切開至關節(jié)腔，外推髕骨致脫位，切斷翼狀皺襞，于上、下止點處完整切除ACL，查前抽屜試驗及Lachman試驗為陽性，然后用2 mm鉆頭自脛骨結節(jié)內(nèi)上骨面向原前交叉韌帶下止點鉆取骨道，通過該骨道再向上、外、后至髁間窩外側壁后部，近ACL上止點處鉆取骨道，鉆通至股骨外髁外側骨面，然后改用3.5mm鉆頭于股骨骨道外側由外向內(nèi)擴大股骨骨道深達5mm，使股骨骨道呈瓶頸樣，適應半腱肌腱一端骨塊嵌入。用直針引導牽引線，將一端帶骨塊的半腱肌腱肌腱側自股骨骨道外口導入關節(jié)腔，從脛骨骨道拉出，拉緊時骨塊嵌入股骨骨道外側端，于屈膝30°位拉緊，經(jīng)脛骨骨橋，懸吊固定。查前抽屜試驗及Lachman試驗陰性后，慶大霉素鹽水沖洗創(chuàng)口。實驗側先將脛骨側骨道內(nèi)口涂薄層耳腦膠封閉內(nèi)口，將準備好的骨髓單個核細胞懸液用注射器針頭通過脛骨骨道外口注入脛骨骨道，邊注邊退，完畢后用耳腦膠封閉外口。對照側不予注射細胞，而僅于脛骨骨道內(nèi)外口封閉薄層耳腦膠。創(chuàng)口逐層間斷縫合，患肢不予以固定，傷口常規(guī)換藥，肌注青霉素3d預防感染。術后籠養(yǎng)，自由活動。

1.2.3 生物力學檢測 于術后2、4、8、12周分別將6只實驗動物處死取材，將膝關節(jié)ACL外周圍軟組織去除，股骨和脛骨各保留3cm長，股骨與脛骨端分別固定于生物力學試驗機（MTS 858Mini Bionix）上，使拉力經(jīng)過韌帶的軸線。測試前將脛骨端移植肌腱骨道外的軟組織及縫線結均去除，以期望使脛骨端腱－骨界面成為拉力測試對象，行最大拉脫負荷實驗，測試移植肌腱的腱－骨界面抗拉伸強度，按5mm／min速度加載負荷，記錄拉脫或斷裂負荷及重建韌帶的斷裂部位。因各測試對象的移植肌腱的長度、骨道直徑和長度接近，各組樣本的最大載荷未用隧道長度來標準化，直接取其絕對值作比較。

2 結 果

2.1 大體觀察結果 24只實驗動物均未出現(xiàn)術后感染，處理標本時見膝關節(jié)重建的ACL連續(xù)性完整，其中4只實驗側膝關節(jié)內(nèi)見輕微的滑膜炎癥和關節(jié)腔少量積液，關節(jié)腔內(nèi)未見異位骨化，未見纖維組織過度形成及關節(jié)僵直。

表1 重建韌帶斷裂部位（n）

表2 最大抗拉脫（斷）強度（，N）

表2 最大抗拉脫（斷）強度（，N）

時間（周） 實驗組 對照組t P 2 11.78±2.3211.44±2.080.272 ＞0.054 21.97±3.0816.29±2.033.769 ＜0.058 29.97±2.6921.62±2.026.076 ＜0.0512 34.82±2.5531.39±2.512.347 ＜0.05

2.2 生物力學檢測結果 為了更有效地觀察腱－骨界面的效果，本實驗股骨側采用骨塊鑲嵌式固定，旨在使股骨側達到更大的固定強度，在拉伸試驗中，主要觀測脛骨側腱－骨界面的抗拉伸強度。在術后2、4、8周，重建韌帶斷裂均發(fā)生在脛骨骨道內(nèi)，即韌帶由骨道內(nèi)拔出。術后12周，對照側有1例自肌腱部分斷裂，5例從脛骨骨道拔出；實驗側有3例自肌腱部分斷裂，3例從脛骨骨道拔出。所有實驗動物均未見骨塊完全從股骨骨道拔出（表1）。隨著時間的推移，實驗側和對照側的抗拉斷強度均有增加；術后2周，兩組數(shù)值差異無統(tǒng)計學意義；在術后4、8、12周抗拉斷強度的測試結果中，實驗側抗拉斷強度與對照側相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即實驗側抗拉斷強度大于對照側，見表2。

3 討 論

目前，ACL重建的方法很多，由于腘繩肌肌腱取材方便、創(chuàng)傷小、強度可靠、取材后對供區(qū)功能影響小，故臨床應用較多。然而，這需要移植物的肌腱組織與骨道的骨組織形成腱－骨愈合，這是一個纖維組織形成連接，新骨形成，骨向肌腱內(nèi)長入，局部纖維不斷重建的復雜過程［3－5］。在術后早期，腱－骨界面成為愈合過程中最薄弱的環(huán)節(jié)，尤其是腱骨組織處于關節(jié)腔內(nèi)的內(nèi)環(huán)境中。因此，許多學者認為針對此種術式的術后康復治療時間需要“延長至術后8周”。移植物與骨道形成牢固的固定連接可以有利于早期積極地行功能康復練習［6］，促進膝關節(jié)功能的康復，所以肌腱移植物在骨道中形成有效的愈合對于ACL的成功重建是非常必要的。

骨髓中富含基質干細胞、骨祖細胞和骨內(nèi)膜細胞等，骨髓成骨特性近年來的研究主要集中在骨髓基質干細胞的作用上。Lim等［7］在兔身上用含骨髓基質干細胞的纖維蛋白膠涂抹在自身腘繩肌腱上重建ACL，對照側與實驗側的生物力學測試在術后2周與4周比較差異無統(tǒng)計學意義；第8周時實驗側的最大拔出負荷和剛度明顯高于對照側，提示骨髓基質干細胞能促進腱－骨結合部位的愈合。骨髓中的有核細胞為每毫升32×106個，每18000個有核細胞中僅有1個骨髓基質干細胞，即每毫升骨髓中有約2000個骨髓基質干細胞［8］。雖濃度很低，但Karaoglu等［9］的研究顯示，新鮮骨髓組織同樣有促進腱骨愈合的作用，提示骨髓的成骨特性可能基于骨髓內(nèi)諸多成分的相互作用。為加強重建術后骨道內(nèi)骨髓基質干細胞濃度，本實驗應用密度梯度離心提取技術，將骨髓單個核細胞提取后直接注于腱骨界面，操作簡潔，避免了細胞培養(yǎng)過程有可能帶來的污染、細胞活性差等問題。采用耳腦膠對骨道口進行封閉，耳腦膠的固化時間小于15s，聚合熱低，局部刺激小，在體內(nèi)約4周可降解為水溶性物而進入體內(nèi)代謝排出，以往常用于腦脊液漏的修補。應用耳腦膠封閉骨髓道口后，隔斷了關節(jié)腔與骨道內(nèi)的聯(lián)系，理論上一定時間段內(nèi)避免了關節(jié)液對骨髓道內(nèi)基質干細胞的稀釋及基質干細胞向關節(jié)腔流失。

有效的腱骨愈合還需要避免受關節(jié)腔內(nèi)滑液中抑制因素作用的影響。Berg等［10］在兔子的膝關節(jié)做平行于ACL的股骨和脛骨髓道，觀察髓道在關節(jié)內(nèi)環(huán)境下愈合的情況，顯示骨髓道在遠離關節(jié)腔的部分明顯比靠近關節(jié)腔的部分愈合要好，越靠近關節(jié)腔，愈合的時間越長。運用肌腱移植物進行ACL重建時，腱－骨愈合同樣處于關節(jié)腔內(nèi)的條件之下。Demirag等［11］用α2－巨球蛋白阻斷關節(jié)滑液內(nèi)基質金屬蛋白酶的效應，促進腱－骨界面的愈合，證實關節(jié)液中基質金屬蛋白酶對腱骨愈合存在不利影響。鑒于此，實驗中采用了耳腦膠對骨道口進行封閉，利用其固化時間短、局部刺激小、在體內(nèi)可降解時間長等特點，除阻斷關節(jié)腔內(nèi)積液的稀釋作用外，還避免受關節(jié)液內(nèi)抑制因子的影響，更好地促進骨髓道內(nèi)新骨的形成和腱－骨界面膠原纖維的重建，增加腱骨界面的結合力［12］。

本實驗中，術后4、8、12周實驗側的腱－骨界面愈合強度均強于對照側。術后12周，對照側有1例自肌腱部分斷裂，5例從脛骨髓道拔出；實驗側有3例自肌腱部分斷裂，3例從脛骨髓道拔出。說明在干預措施影響下，術后腱－骨界面的愈合強度得到了增加，提示自體骨髓移植的有效性。實驗中未見有從股骨側拔出者，說明了骨塊鑲嵌式固定技術具有較高的固定強度，可以進一步在臨床中應用［13］。

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