吳志剛 劉丹赤 宋 明 丁立孝

（1日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東日照 276826；2西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715）

人工誘導(dǎo)多倍體是番茄（Lycopersicon esculentumMill.）育種的重要手段之一。傳統(tǒng)誘導(dǎo)番茄多倍體的方法主要有愈傷組織法、秋水仙素處理種子或幼苗生長點(diǎn)等方法，而利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行番茄四倍體的離體誘導(dǎo)鮮有報(bào)道。利用組織培養(yǎng)技術(shù)與秋水仙素相結(jié)合的方法培育植物多倍體，具有嵌合體少、試驗(yàn)條件易控制、重復(fù)性好、誘導(dǎo)效率高等諸多優(yōu)點(diǎn)，并在荷花（Yamamoto & Matsumoto，1990）、黃瓜（張承妹和陸家安，1995）等多種植物上都取得了成功。本試驗(yàn)對番茄同源四倍體的離體誘導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為番茄品種改良和種質(zhì)資源的豐富與創(chuàng)新提供了一條新的途徑。同時(shí)對番茄四倍體與二倍體植株的形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)進(jìn)行比較分析，從而為番茄四倍體植株的鑒定、優(yōu)良四倍體株系的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2007年在西南大學(xué)重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試番茄品種為渝粉109。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 番茄四倍體的離體誘導(dǎo) 將番茄種子滅菌后，接種到1/2MS固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)（吳志剛 等，2006）。待子葉平展后，切取健壯無菌苗的子葉進(jìn)行分化培養(yǎng)。分化培養(yǎng)基為 MS+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1卡拉膠+1 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA，pH 5.8～6.0。

愈傷組織分化形成綠芽生長點(diǎn)后，選擇芽點(diǎn)較多、生長正常的愈傷組織為材料，分別在含秋水仙素的固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)。固體培養(yǎng):秋水仙素濃度分別為 0.05%、0.10%、0.20%、0.40%，處理24～96 h；液體培養(yǎng):秋水仙素濃度分別為0.05%、0.10%、0.20%，處理12～72 h。對照接入到不含秋水仙素的培養(yǎng)基上。每處理30個(gè)愈傷組織，處理后轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)20 d后，觀察并統(tǒng)計(jì)分化情況和外植體死亡率。培養(yǎng)得到完整植株后，用根尖進(jìn)行植株倍性鑒定，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

倍性鑒定采用陳學(xué)森（2004）和王志敏等（2010）的方法進(jìn)行直接鑒定。當(dāng)試管苗不定根長至2～3 cm時(shí)，切取根尖1 cm左右，用飽和對二氯苯溶液預(yù)處理55 min；然后將處理好的根尖放入60 ℃ 1 mol·L-1的HCl溶液中處理8 min，清水沖洗徹底后進(jìn)行染色體壓片。對于染色體記數(shù)清晰、形態(tài)完整的壓片制作成永久封片。

1.2.2 四倍體與二倍體植株特性的比較分析 ① 形態(tài)學(xué)比較:在相同生長階段和生長條件下，選擇移栽40 d后的二倍體與四倍體番茄各4株進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)的比較。分別測量株高、成熟葉片長度及寬度、基部莖粗和第 1～3節(jié)間長度，取平均值。② 生理指標(biāo)比較:葉綠素含量測定參照李合生（2001）的 95%乙醇浸提法，選擇生長階段和生長條件相同的二倍體與四倍體番茄各3株，摘取新鮮的成熟葉片，分別測定并計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量及葉綠素總含量；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)酶活性單位；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán) G-250染色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法（李合生，2001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄四倍體的離體誘導(dǎo)

2.1.1 固體培養(yǎng)法誘導(dǎo)效果 愈傷組織分化形成綠芽生長點(diǎn)后，將愈傷組織接入到含不同濃度秋水仙素的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行離體誘導(dǎo)。此時(shí)不定芽生長點(diǎn)正處于細(xì)胞分裂的活躍時(shí)期，容易被秋水仙素誘導(dǎo)而加倍，從而使部分不定芽最終發(fā)展成為四倍體植株。誘導(dǎo)結(jié)果見表 1，采用固體培養(yǎng)法進(jìn)行離體誘導(dǎo)，共獲得9株四倍體植株，取得了較好的誘導(dǎo)效果。

四倍體誘導(dǎo)的關(guān)鍵就是既要獲得較高的加倍頻率，又要保證外植體的成活率及再生植株的數(shù)量，因此誘導(dǎo)時(shí)間和藥劑濃度相適應(yīng)，才能達(dá)到理想的誘導(dǎo)效果。表 1表明:在秋水仙素濃度為0.20%、處理時(shí)間為48 h時(shí)，6株再生植株中獲得3株變異植株，誘導(dǎo)效果最佳。

2.1.2 液體培養(yǎng)法誘導(dǎo)效果 番茄外植體對秋水仙素較為敏感，由于液體培養(yǎng)比固體培養(yǎng)作用更為直接，所以對外植體的傷害程度也較大。外植體經(jīng)秋水仙素溶液浸泡后，多數(shù)不定芽停止生長，死亡率較固體培養(yǎng)大幅增加，處理后獲得再生植株數(shù)較少，僅有 2株變異植株（表 2）。

表1 固體培養(yǎng)法對帶綠芽生長點(diǎn)愈傷組織的誘導(dǎo)效果

2.2 倍性鑒定

利用根尖壓片檢測染色體數(shù)目，未經(jīng)秋水仙素處理的試管苗，其體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=2x=24（圖 1-a）。經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)后的再生植株中，存在一定比例的嵌合體；其中變異植株經(jīng)連續(xù)多代繼代培養(yǎng)，獲得了部分純合四倍體植株，其體細(xì)胞染色體數(shù)目為 2n=4x=48（圖1-b）。檢測中也發(fā)現(xiàn)了含八倍體細(xì)胞的嵌合體類型，染色體數(shù)目為2n=8x=96（圖1-c），這可能是由于處理時(shí)間過長，誘導(dǎo)產(chǎn)生的四倍體細(xì)胞在秋水仙素作用下再次加倍所致。

2.3 番茄四倍體與二倍體的比較分析

2.3.1 四倍體與二倍體植株形態(tài)比較 試管苗培養(yǎng)階段，四倍體與二倍體相比，植株相對粗壯，節(jié)間短，葉色深，根數(shù)較多，但植株形態(tài)差異并不十分明顯（圖2）。

表2 液體培養(yǎng)法對帶綠芽生長點(diǎn)愈傷組織的誘導(dǎo)效果

圖1 不同倍性番茄體細(xì)胞染色體數(shù)目

移栽40 d后的番茄四倍體植株高大，莖稈粗壯，節(jié)間長，葉片寬大，葉色深綠，與二倍體植株差別明顯（圖3，表3）。

2.3.2 生理指標(biāo)比較 四倍體植株葉綠素總量為2.42 mg·g-1，明顯高于二倍體（1.77 mg·g-1），而且葉綠素a含量和葉綠素b含量均明顯高于二倍體，但葉綠素a/b值差別不大；四倍體植株類胡蘿卜素含量也高于二倍體，為二倍體的133%（表4）。

通過對POD和SOD活性的測定發(fā)現(xiàn)（表5），四倍體番茄植株酶活性加強(qiáng)，生活力提高。四倍體植株P(guān)OD活性為9 U·g-1，二倍體為4 U·g-1；四倍體植株SOD活性為201.7 U·g-1，而二倍體僅為140.2 U·g-1。

圖2 四倍體與二倍體組培苗形態(tài)比較

圖3 四倍體與二倍體植株同位裂片大小比較

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的產(chǎn)物，反映細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件的反應(yīng)強(qiáng)度。四倍體植株MDA含量為7.1×10-3μmol·g-1，二倍體為 8.9×10-3μmol·g-1（表5），在一定程度上反映了二倍體植株較四倍體更易受外界環(huán)境的影響。四倍體植株可溶性蛋白含量與二倍體之間差異明顯，分別為 34.4 mg·g-1和 24.1 mg·g-1（表 5）。

上述生理指標(biāo)的分析表明，在相同的栽培環(huán)境下，四倍體植株的生理狀態(tài)優(yōu)于二倍體，這為四倍體植株抗逆性奠定了良好的基礎(chǔ)。而四倍體植株抗逆性的具體表現(xiàn)還有待進(jìn)一步研究。

表3 四倍體與二倍體植株形態(tài)比較

表4 四倍體與二倍體植株葉片光合色素含量比較

表5 四倍體與二倍體植株生理指標(biāo)比較

3 討論

番茄多倍體育種研究已經(jīng)很多年，其誘導(dǎo)方法以秋水仙素處理番茄幼苗莖尖（劉艷俊 等，1991；饒升土 等，1996）和種子為主（喬永剛，2003），而利用組織培養(yǎng)技術(shù)與秋水仙素相結(jié)合進(jìn)行離體誘導(dǎo)的方法鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)找到了一條通過離體誘導(dǎo)番茄同源四倍體的有效途徑，且研究結(jié)果為:多倍體植物葉片在形態(tài)上會(huì)表現(xiàn)出巨大性、葉綠素含量隨倍性的增加而增加等內(nèi)容與許多研究者的結(jié)論一致（劉惠吉 等，1990；劉文革 等，2003a，2003b；王鎮(zhèn) 等，2010）。為進(jìn)一步提高誘導(dǎo)率，可以嘗試變溫誘導(dǎo)、添加二甲基亞砜（DMSO）、選擇其他化學(xué)誘變劑等方法開展誘導(dǎo)工作。同時(shí)應(yīng)適時(shí)移栽進(jìn)行田間試驗(yàn)，觀測番茄四倍體植株生長狀態(tài)，掌握多倍體材料的生育期、育性以及果實(shí)性狀、結(jié)實(shí)率等特征，并檢測后代倍性及表現(xiàn)型的穩(wěn)定性，為優(yōu)良株系的選育奠定基礎(chǔ)。

目前番茄多倍體育種中真正有價(jià)值的多倍體材料很少。如其他植物一樣，染色體加倍后會(huì)引起一系列生理生化變化和不良放應(yīng)，如孕性降低、結(jié)實(shí)率差、群體中非整倍體比例增高等。只有在良好培育條件下，生理狀態(tài)得以調(diào)整和恢復(fù)，并輔以嚴(yán)格的人工選擇，發(fā)掘其優(yōu)良性狀，與其他的育種手段相結(jié)合，同源四倍體才可能在生產(chǎn)上利用。

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