賈利元 張淑紅 張恩平 周寶利

（1商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南商丘 476005；2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，設(shè)施園藝省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110866）

土壤致病菌是引起蔬菜減產(chǎn)的原因之一，連作導(dǎo)致土壤中茄子黃萎病菌的積累，從而引起茄子黃萎病的普遍發(fā)生。目前生產(chǎn)中尚無有效的方法來控制該病害的發(fā)生（Zhang et al.，2006；Zhou et al.，2007）。植物的化感作用在自然界普遍存在，近年來，國內(nèi)外學(xué)者在植物化感作用方面做了大量研究工作（Muhsin et al.，2001；Chaudhary & Bhansali，2006），植物對(duì)微生物的化感作用備受關(guān)注。有些植物的殘?bào)w經(jīng)微生物腐解釋放的化感物質(zhì)，能夠抑制病原微生物的生長(zhǎng)與繁殖（Aryaa et al.，1995；宋衛(wèi)國 等，2005；Chaudhary & Bhansali，2006）。許多研究針對(duì)不同的病菌進(jìn)行了植物材料的抑菌篩選，大量的研究表明，菊科、唇形科、百合科、葫蘆科、豆科、十字花科等植物的提取物具有廣泛的抑菌作用（李玉平 等，2003；陸志科和謝碧霞，2005；李麗娜 等，2006）。沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茄子嫁接栽培與生態(tài)防治課題組針對(duì)茄子黃萎病菌，對(duì)54種植物提取物進(jìn)行了抑菌篩選，結(jié)果表明苦參提取物對(duì)茄子黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的化感抑制作用，并提取了苦參的主要活性成分苦參生物堿和苦參黃酮類化合物（Zhang et al.，2006）。

從天然植物中提取抗菌活性物質(zhì)的研究目前已有報(bào)道，但有關(guān)它們的抗菌機(jī)理的研究卻甚少。從現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料來看，有的是直接作用于病菌，如抑制孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)，有的則是間接干擾病菌的代謝過程，影響其結(jié)構(gòu)和功能等（Eksteen et al.，2001；Bowers ＆ Locke，2002）。許多病菌在入侵植物細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生各種降解多糖的胞外酶，通過酶分解植物細(xì)胞壁中的多糖物質(zhì)，從而使完整的細(xì)胞崩潰，進(jìn)而達(dá)到侵染的目的。近年來，國內(nèi)外的研究主要集中在苦參提取物的抑菌活性上，而抑菌機(jī)理的研究甚為薄弱。為進(jìn)一步探索苦參提取物對(duì)茄子黃萎病菌的抑制作用，本試驗(yàn)在已有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，明確苦參提取物中起化感抑菌作用的主要活性成分是苦參生物堿和苦參黃酮類化合物，并通過這兩種成分對(duì)茄子黃萎病菌菌絲干質(zhì)量、菌絲毒素含量與胞外酶活性的影響來分析其化感抑制作用機(jī)理，旨在為茄子黃萎病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦參（Sophora flavescens，Ait）購于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院。

茄子黃萎病菌（VerticilliuMdahliae）從沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜試驗(yàn)基地病圃（日光溫室）的茄子病株上分離獲得，按照柯赫氏法則（Koch’s postulate）對(duì)其進(jìn)行分離鑒定。

1.2 苦參活性成分的分離提取

提取:稱取苦參50 g，粉碎后按1V︰2V加入蒸餾水，并加入5 g根際土以接種微生物，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中腐解15 d，加入80%乙醇（1V︰5V），超聲波（KQ-100DB型超聲波數(shù)控清洗器）振蕩30 min，4 000 r·min-1離心20 min，過濾，濾渣再用60%乙醇提取2次，合并濾液，濃縮后濃縮液放4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

黃酮類化合物的分離提取:取上述濃縮液 20 ML，經(jīng)石油醚脫酯后，加入等量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，冷凍干燥后得到的黃色粉末即為苦參黃酮類化合物（崔永明等，2006）。

苦參總生物堿的分離提取:取上述濃縮液 20 ML，減壓蒸餾，除盡乙醇，膏狀物用乙酸乙酯溶解后，用2%鹽酸調(diào)pH為3，冰箱放置過夜，過濾，取濾液用乙醚反復(fù)萃取，棄去醚層，合并水層，用碳酸鈉調(diào)pH為9，用等體積的三氯甲烷萃取至無生物堿反應(yīng)（用改良碘化鉍鉀試劑檢測(cè)，無桔黃色沉淀出現(xiàn)），合并三氯甲烷萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收三氯甲烷得到褐色生物堿（袁靜 等，2005）。

1.3 苦參提取物生物活性的測(cè)定

1.3.1 抑菌活性的測(cè)定 抑菌試驗(yàn):將上述分離得到的生物堿和黃酮類化合物溶解，分別配成母液，濃度為50 mg·mL-1。采用含毒介質(zhì)法，將生物堿和黃酮類化合物母液分別與PDA培養(yǎng)基混合，配成含有不同濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg·mL-1）生物堿和黃酮類化合物的培養(yǎng)基；然后在無菌條件下，每個(gè)培養(yǎng)皿接 1個(gè)活化培養(yǎng)的茄子黃萎病菌菌絲圓片（直徑為6 mm），每處理3次重復(fù)，以不含苦參提取物的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照（CK）。24 ℃下暗培養(yǎng)，8 d后用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。

菌絲干質(zhì)量測(cè)定:將苦參提取物與馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基混合，配成含有不同濃度（1、5、10、20 mg·ML-1）苦參提取物的培養(yǎng)基，取80 ML裝入150 mL的三角瓶中，高壓滅菌。分別接入兩片直徑為6 mm的黃萎病菌菌盤，每處理3次重復(fù)。在24 ℃下恒溫振蕩（110 r·min-1）培養(yǎng)10 d后，用無菌濾紙過濾，半角濾紙上殘?jiān)?0 ℃烘干，得菌絲干質(zhì)量。

1.3.2 黃萎病菌菌絲毒素含量的測(cè)定 將苦參提取物與馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基混合，配成含有不同濃度（1、5、10、20 mg·mL-1）苦參提取物的培養(yǎng)基，取80 ML裝入150 ML的三角瓶中，高壓滅菌。分別接入兩片直徑為6 mm的黃萎病菌菌盤，每處理3次重復(fù)。在24 ℃下恒溫振蕩（110 r·min-1）培養(yǎng)10 d后，用無菌濾紙過濾，濾液5 000 r·min-1離心20 min，取其上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至4 mL，于OD=280 nm處測(cè)光密度值（趙明敏 等，2006）。

1.4 苦參提取物對(duì)黃萎病菌胞外酶活性的測(cè)定

酶液提取:將苦參提取物與PDA液體培養(yǎng)基混合配成含不同濃度（1、5、10、20 mg·ML-1）苦參提取物的培養(yǎng)基，取30 mL裝入150 ML的三角瓶中，高壓滅菌。分別接入兩片直徑為6 mm的黃萎病菌菌盤，每處理3次重復(fù)。在24 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)14 d后，用無菌濾紙過濾，所得濾液離心（常溫，110 r·min-1），其上清液為粗酶液。測(cè)定纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶活性的OD值（沈壽國 等，2005）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參提取物對(duì)茄子黃萎病菌的抑菌作用

由表1可知，苦參黃酮類化合物在濃度為4.00 mg·ML-1培養(yǎng)7 d時(shí)對(duì)茄子黃萎病菌的抑菌率達(dá) 100.00%，濃度為 1.00 mg·mL-1培養(yǎng) 7 d時(shí)抑菌率大于 95%；而苦參生物堿濃度為 4.00 mg·mL-1培養(yǎng)7 d時(shí)的抑菌率為69.57%，與苦參黃酮類化合物在濃度為0.25 mg·ML-1培養(yǎng)7 d時(shí)的抑菌率相同，苦參生物堿在濃度為0.25 mg·mL-1培養(yǎng)7 d時(shí)的抑菌率僅為8.70%?？鄥ⅫS酮類化合物濃度大于1.00 mg·ML-1培養(yǎng)9 d時(shí)抑菌率在93%以上，培養(yǎng)12 d時(shí)的抑菌率還維持在90%左右，具有較強(qiáng)的抑菌效果。而苦參生物堿在濃度為4.00 mg·ML-1培養(yǎng)12 d時(shí)抑菌率達(dá)到了73.06%，但在低濃度（0.25 mg·ML-1）條件下的抑菌率還是較低，僅為14.08%。

由表2可知，不同濃度的苦參提取物對(duì)茄子黃萎病菌菌絲干質(zhì)量產(chǎn)生不同的抑制作用，并且菌絲干質(zhì)量隨苦參提取物濃度增加而逐漸降低?？鄥⑻崛∥餄舛葹?0 mg·mL-1時(shí)，菌絲干質(zhì)量較低，為 0.138 g；苦參提取物濃度大于5 mg·ML-1時(shí)，菌絲干質(zhì)量均與對(duì)照差異達(dá)顯著水平，提取物濃度為1 mg·ML-1時(shí)，菌絲干質(zhì)量與對(duì)照差異不顯著。

2.2 菌絲毒素含量

毒素是病原物的代謝產(chǎn)物，對(duì)寄主組織有明顯的損傷作用，在植物病害發(fā)生、發(fā)展過程中具有明顯的致病或致毒作用?？鄥⑻崛∥锾幚砗?，茄子黃萎病菌菌絲毒素含量隨著提取物濃度的增加呈降低的趨勢(shì)，各濃度處理菌絲毒素含量均與對(duì)照差異顯著。苦參提取物濃度為5 mg·ML-1和10 mg·ML-1處理的菌絲毒素含量差異不顯著（表2）。

表1 苦參提取物對(duì)茄子黃萎病菌的抑菌作用

表2 苦參提取物對(duì)茄子黃萎病菌菌絲干質(zhì)量及胞外酶活性的影響

2.3 胞外酶活性

4種胞外酶的活性均隨著苦參提取物處理濃度的增加而降低（表 2）。濃度為 20 mg·mL-1的處理果膠酶活性最低，與對(duì)照差異達(dá)顯著水平；而苦參提取物濃度為1、5 mg·ML-1及5、10 mg·ML-1處理間的果膠酶OD值差異不顯著?？鄥⑻崛∥餄舛葹?、5 mg·ML-1的處理半纖維素酶OD值與對(duì)照差異不顯著，濃度為10、20 mg·ML-1的處理與對(duì)照差異達(dá)顯著水平。當(dāng)苦參提取物濃度低于5 mg·mL-1時(shí)，纖維素酶OD值與對(duì)照差異不顯著。苦參提取物濃度為20 mg·mL-1時(shí)蛋白酶變化顯著，OD值最低，與對(duì)照差異達(dá)顯著水平，1、5、10 mg·mL-1處理間蛋白酶OD值差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

植物與微生物之間存在著兩種化感作用，一種是促進(jìn)作用，連作和輪作條件下茄子根系分泌物對(duì)茄子黃萎病病原菌有明顯的化感促進(jìn)作用（Wang et al.，2005）；一種是化感抑制作用，中國細(xì)香蔥根系分泌物可抑制假單胞菌引起的番茄枯萎病菌繁殖（Yu，1999）。如何利用化感作用的抑制效應(yīng)進(jìn)行病蟲害的生物防治已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)茄子黃萎病菌起化感作用的苦參主要活性成分是黃酮類化合物，濃度為4.00 mg·mL-1培養(yǎng)7 d對(duì)茄子黃萎病菌的抑菌率達(dá)100.00%，而苦參生物堿在濃度為0.25 mg·mL-1培養(yǎng)7 d的抑菌率僅為8.70%。當(dāng)其他條件固定不變時(shí)，隨著苦參提取物濃度的提高，茄子黃萎病菌分泌的果膠酶活性隨之越低，纖維素酶和蛋白酶的活性均有降低趨勢(shì)，而半纖維素酶活性變化不明顯。本試驗(yàn)僅針對(duì)苦參生物堿和黃酮類化合物進(jìn)行了初步的抑菌試驗(yàn)及抑菌機(jī)理的研究，在明確了起主要起抑菌作用的是黃酮類化合物的基礎(chǔ)上，后續(xù)的試驗(yàn)應(yīng)集中在黃酮類化合物的分離、田間抑菌效果及機(jī)理的研究。

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