姜洪芳，石寶俊，趙伯濤，張衛(wèi)明*

(1.南京師范大學，江蘇南京 210046;2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京 210042)

香水蓮花(Nymphaea hybrid)是睡蓮科(Nymphaea)睡蓮屬熱帶大型睡蓮，是一種多年生宿根水生花卉，有很高的觀賞價值。香水蓮花花朵碩大、色彩鮮艷，香氣清雅宜人，集當今世界各地荷、蓮珍貴品種之優(yōu)點于一身，因而成為備受青睞的園林水生觀賞花卉。近年來我國南方數(shù)省已開始引種，并且發(fā)展到了一定的規(guī)模。源于香水蓮花的各種產(chǎn)品也開始不斷開發(fā)，鮮花可供生食，亦可泡茶、浸酒或隨其他食物燉煮，以子房連同雄蕊一起經(jīng)高溫烘焙制成的香水蓮花茶，也有以其提取物制成的九品蓮花酒等等，均具有一定的保健作用［1－3］。動物實驗已經(jīng)證明香水蓮花具有降血脂、抗氧化、抑制酪氨酸酶及預防酒精肝［4－7］等生物活性，但化學成分研究相對較少。

高速逆流色譜(High－speed Countercurrent Chromatography，簡稱HSCCC)技術是應用兩相互不混溶的溶劑系統(tǒng)在支撐管內(nèi)高速行星運動的方式下進行天然產(chǎn)物的分離純化，因而沒有不可逆吸附，具有樣品無損失、無污染、高效、快速和大制備量分離的優(yōu)點。所以，在國內(nèi)外已被廣泛應用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等領域中活性物質(zhì)的分離純化［8－10］。本文應用高速逆流色譜(HSCCC)對香水蓮花的黃酮類化合物進行了純化，經(jīng)鑒定為柚皮素，此化合物為首次從該植物中分離得到，為香水蓮花的進一步開發(fā)應用奠定了化學基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

高速逆流色譜儀:TBE－300A半制備型(上海同田生化技術有限公司)，TBD－2000紫外檢測儀，TBP－50A恒流泵，TC－1050恒溫循環(huán)器，聚四氟乙烯(PTFE)管分離柱(內(nèi)徑1.6 mm，分離柱體積280 mL)，N2000色譜工作站和溶劑選擇系統(tǒng)(浙江大學智達信息工程有限公司)，進樣環(huán)20 mL。

高效液相色譜儀:Agilent 1200 HPLC(美國安捷倫公司)，G1354A四元泵，G1313A自動脫氣機，G1316柱溫箱，G1315B二極管陣列檢測器。

HP1100LC－MSD型質(zhì)譜儀;BRUKER AVANCE 500型核磁共振儀;

色譜柱:Ф7.8 cm ×75 cm;

超聲波清洗器:KQ－600DE型 (昆山市超聲儀器有限公司)

薄層層析用硅膠H，柱層析硅膠160～200目，青島海洋化工廠生產(chǎn);

萃取及硅膠柱分離、HSCCC分離用的試劑石油醚、氯仿、甲醇、乙酸乙酯和正己烷均為分析純，高效液相色譜(HPLC)分析用甲醇為色譜純，實驗用水為超純水。

香水蓮花帶雄蕊的干燥花托，浙江省溫州市三心美德投資有限公司提供。七月采摘，剝?nèi)ポ嗥突ò?，貼近花托基部切去花梗，曬干或烘干。經(jīng)鑒定其基原為Nymphaea hybrid。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗提物的制備

稱取70℃干燥2 h的香水蓮花2.74 kg，用75%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取2次，1 h/次，提取液合并濃縮至無醇味，加入少量的水，離心后得到3個不同部分:上層為橙黃色油狀物;中間層為橙紅色水溶液;底層為黃色沉淀物，薄層層析檢測表明底層黃色沉淀物以黃酮類物質(zhì)為主，用乙酸乙酯回流提取3次，回收乙酸乙酯，干物質(zhì)重40 g，作為硅膠柱分離用樣品。

1.2.2 硅膠柱層析分離

稱取160～200目柱層析用硅膠2000 g，干法裝柱(Ф7.8cm ×75cm)。將1.2.1 中得到的樣品以適量醋酸乙酯溶解，硅膠拌樣上柱。以石油醚－乙酸乙酯梯度洗脫，每500 mL為一流分，經(jīng)薄層層析檢測后合并相同流分，108－112流分經(jīng)鑒別主要為黃酮類化合物，作為高速逆流分離用樣品。

1.2.3 兩相溶劑系統(tǒng)的選擇

對不同配比的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水組成的溶劑系統(tǒng)進行試管實驗，通過分層時間和上下相體積比粗篩溶劑系統(tǒng)，選取其中的5種配比，用HPLC法分析，計算目標化合物 C的分配系數(shù)K［11－12］。

分別按照 1∶1∶1∶1、1∶1∶2∶1、1∶2∶1.5∶1、1∶1.2∶1.5∶1、1∶1.2∶2∶1這 5 種體積比配制各溶劑系統(tǒng)。分別取相同體積的上相與下相置于試管中，加入一定量的樣品，劇烈振搖使樣品充分溶解，靜置分層。達到分配平衡后，分別取上相和下相各1.0 mL，揮干溶劑后用等量的甲醇溶解，經(jīng)HPLC分析得到目標化合物C在上相中的峰面積(AU)與下相中的峰面積(AL)，按照公式K=AU/AL計算得到目標化合物C的分配系數(shù)。

1.2.4 HSCCC分離用溶劑體系和樣品溶液的配制

用分液漏斗中配制正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(體積比為1∶1.2∶2∶1)兩相溶劑體系，充分振搖后靜置分層。將上相和下相溶液分離后，超聲脫氣20 min，備用，上相為固定相，下相為流動相。

準確稱取在1.2.2中分離得到的300 mg樣品，溶解于20 mL流動相(下相溶液)，過濾后備用。

1.2.5 HSCCC 分離純化方法

將已脫氣的固定相(上相)以10 mL/min的速度泵入HSCCC分離管，待固定相充滿整個分離管后，開啟循環(huán)水浴并將溫度設定為25℃。開啟主機電源，調(diào)節(jié)主機轉速為830 r/min，正向旋轉，以2 mL/min的流速泵入流動相(下相)，待流動相從柱出口流出、且固定相不再流出，表明上下相在分離管中達到平衡后，基線穩(wěn)定后，由進樣閥注入20 mL樣品溶液進行分離，檢測波長為280 nm，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖手動收集各峰組分，HPLC檢測其純度。分離結束后，停止轉動主機，用無水乙醇將分離管吹洗干凈。

1.2.6 HPLC分析條件及結構鑒定

HPLC色譜條件:Eclipse XDB－C18分離柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相為甲醇∶1.0%磷酸 =50∶50，流速為 1.0 mL/min;柱溫為 25 ℃，DAD檢測器，檢測范圍190～400 nm;進樣量10 μL。

HSCCC分離得到的組分的結構根據(jù)質(zhì)譜、核磁共振氫譜(1H－NMR)和核磁共振碳譜(13C－NMR)的數(shù)據(jù)進行鑒定。

2 結果與討論

2.1 HSCCC溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化選擇

溶劑系統(tǒng)是決定HSCCC分離樣品效果的最關鍵因素。不同的溶劑系統(tǒng)由于黏度、極性和密度等性質(zhì)的差異，對相同的成分會產(chǎn)生不同的溶解、分配能力，因而形成分配系數(shù)的差異。根據(jù)色譜理論，利用HSCCC分離樣品的必要條件是目標物能穩(wěn)定的溶于兩相溶劑;目標物在兩相中具有合適的分配系數(shù)，必須在0.5和2之間。若K遠小于1，樣品會很快隨流動相流出，達不到分離效果;若K遠大于1，樣品的出峰時間會延長，形成寬峰。本研究根據(jù)香水蓮花提取物的目標化合物C在不同組成比例的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)，從中優(yōu)選出具有合適分配系數(shù)的溶劑體系，結果見表1。

表1 化合物C在不同比例的溶劑體系中的分配系數(shù)(K)

由表1可見，在溶劑體系1、3、4條件下，化合物C的分配系數(shù)偏大，在固定相中的保留時間過長，不適合分離，而在2的條件下，化合物C易和不被保留的雜質(zhì)幾乎同時流出而沒有達到很好的分離，在溶劑體系5中，化合物C的分配系數(shù)接近1，而且所需分離時間較短，5是較為適宜的HSCCC分離溶劑體系。

2.2 HSCCC檢測波長的選擇

化合物C的HPLC－DAD檢測圖譜(見圖1)可知，由220～230 nm、280～300 nm 2個較強的的吸收帶組成，320～340nm處的吸收帶為肩峰。雖然色譜峰在225 nm吸收強度大，但由于樣品中的其他化合物及流動相(乙酸乙酯、甲醇等)在210～230 nm下均有較強的吸收，在HSCCC分離中這種溶劑吸收帶來的基線背景吸收值過高，且影響基線的平穩(wěn)。因此，綜合考慮選擇HSCCC分離的檢測波長為280 nm。

圖1 化合物C的HPLC－DAD檢測圖譜

2.3 HSCCC分離純化結果

采用1.2.5 節(jié)的條件對 1.2.2中得到的108－112流分進行分離純化，分離時間為1.5h，固定相保留率為80%。根據(jù)HSCCC圖譜手動收集得到3個組分(見圖2)，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)其中A、B二峰均為雜質(zhì)峰，C峰較純。將其收集，濃縮干燥，質(zhì)量為80 mg。

圖2 香水蓮花底層黃色物質(zhì)硅膠柱分離108－112流分的HSCCC分離圖

2.4 化合物C高效液相色譜檢測純度

采用1.2.6節(jié)的條件，對2.3中的分離產(chǎn)物C峰進行HPLC分析，結果見圖3。使用面積歸一法測定所得組分的純度為98.6%。

圖3 HSCCC分離所得化合物C的HPLC的色譜圖(290nm)

2.5 化合物C的結構鑒定

化合物C:白色粉末，分子式C15H12O5，F(xiàn)ABMS m/z:272［M］+，1H－ NMR(500 MHz，Acetone－d6)δ:12.18(1H，s，5－ OH)，9.51(1H，s，4'－ OH)，8.47(1H，s，7－ OH)，7.41(2H，d，J=8.5 Hz，H－2'，6')，6.91(2H，d，J=8.5 Hz，H－ 3'，5')，5.97(1H，d，J=2.1 Hz，H－ 6)，5.96(1H，d，J=2.1Hz，H－8)，5.47(1H，dd，J=12.8 Hz，2.9Hz，H－2)，3.19(1H，dd，J=12.8Hz，17.1Hz，H－3a)，2.75(1H，dd，J=17.1 Hz，2.9Hz，H－ 3b)。13C－ NMR(500 MHz，Acetone－ d6)δ:80.0(C－ 2)，43.6(C－ 3)，197.3(C－4)，165.4(C－5)，96.9(C－6)，167.4(C－7)，95.9(C－8)，164.5(C－9)，130.9(C－1')，129.1(C－2')，116.2(C－3')，158.8(C－4')，116.2(C－5')，129.1(C－6')。從 NMR 可以看出化合物C為黃酮類化合物，1H－NMR顯示B環(huán)為4'一羥基取代(δ 6.91，3'，5'－ H;7.41，2'，6'－ H)，另外A環(huán)還含有2個酚羥基取代。根據(jù)H－2和H－3的化學位移及偶合常數(shù)，確定C－2為S構型，提示此化合物為二氫黃酮。其NMR數(shù)據(jù)與文獻［13－15］報道的(2s)一柚皮素數(shù)據(jù)基本一致，故化合物鑒定為(2s)一柚皮素(naringenin)。

圖4 柚皮素的結構式

3 結論

本研究將HSCCC應用到香水蓮花黃烷酮類化合物的分離制備，采用正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶1.2∶2∶1，V/V/V/V)四元溶劑系統(tǒng)，香水蓮花粗提物硅膠柱分離流分經(jīng)進一步HSCCC分離純化，結合薄層層析(TLC)和HPLC－DAD光譜，結果表明:分離得到的化合物C為黃烷酮類化合物，并根據(jù)MS分析及1H－NMR、13C－NMR譜圖分析結果鑒定為(2s)一柚皮素。所建立的HSCCC分離方法可用于快速、高效、低成本地分離制備香水蓮花中柚皮素對照品，可為該成分的藥理活性與作用機制研究以及香水蓮花相關產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法的完善提供必要的物質(zhì)基礎。

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