陳秀恩，鄭潔皎，梁貞文

腦卒中是臨床十分常見的疾病，也是導(dǎo)致人類死亡和病殘的主要原因。腦卒中后不僅會出現(xiàn)運(yùn)動功能障礙，還會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知能力降低，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動可促進(jìn)動物海馬的神經(jīng)發(fā)生水平，增加突觸數(shù)量，加快長時(shí)程增強(qiáng)(long term potential,LTP)的形成，從而提高動物的學(xué)習(xí)和記憶能力[2-5]。本研究旨在探索運(yùn)動對老齡大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 單側(cè)腦缺血再灌注動物模型的建立 健康20月齡SD大鼠20只，平均體重(358.53±12.01)g。采用線栓法建立大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MACO)動物模型：10%水合氯醛3ml/kg腹腔麻醉，仰臥綁定，頸前正中切口，分離暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈。用微動脈夾夾閉頸總動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈，在側(cè)頸總動脈剪一個(gè)小口，將直徑0.285mm的尼龍線經(jīng)小口推入，經(jīng)分叉處進(jìn)入頸內(nèi)動脈后撤除微動脈夾，插線經(jīng)頸內(nèi)動脈進(jìn)入大腦中動脈，至遇阻力不能向前推進(jìn)為止，插入深度為1.8 cm。用絲線固定插線，縫合切口。2 h后拔出尼龍線。模型成功的標(biāo)志為大鼠即刻出現(xiàn)左側(cè)Horner征。

1.2 動物分組及運(yùn)動方案 將造模成功的大鼠20只按照體重配對，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將偶數(shù)只分配到試驗(yàn)組(n=10)，奇數(shù)只則分配到對照組(n=10)。由同一研究人員分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食，光照時(shí)間7:00～19:00，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22℃，相對濕度45%～55%。

由不同的研究人員將兩組每天定時(shí)帶到跑臺。試驗(yàn)組接受規(guī)律的運(yùn)動練習(xí)：固定時(shí)間段在跑臺上運(yùn)動30min，持續(xù)1周；運(yùn)動強(qiáng)度采取逐漸加大的方式，首先以5m/min運(yùn)動5min，然后速度增加到8m/min持續(xù)5min，最后以11m/min持續(xù)20min。對照組則允許其在跑臺上自由活動，不限定速度和運(yùn)動方式。共1周。

1.3 評價(jià)指標(biāo)

1.3.1 Morris水迷宮檢測 訓(xùn)練結(jié)束后，由不清楚分組情況的研究人員完成檢測。水迷宮為一圓形黑色橡膠水池，直徑160 cm，水深40 cm，池高50 cm，水溫20℃。池壁上等距標(biāo)設(shè)A、B、C、D 4點(diǎn)，分別用白色貼紙作為標(biāo)記，A點(diǎn)下放一個(gè)6×38 cm圓形黑色橡膠平臺，平臺頂?shù)陀谒? cm。水池中倒入食用黑色色素掩蓋平臺。水迷宮上方安置攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動軌跡。

前3d，每天固定時(shí)間段每只大鼠重復(fù)訓(xùn)練3次，依次選擇B、C、D點(diǎn)入水，將大鼠面向池壁放入水池，同1次訓(xùn)練所有大鼠入水點(diǎn)相同。記錄每個(gè)大鼠尋找到平臺的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency)。如120 s找不到平臺，即將其引上平臺，潛伏期記為120 s。大鼠每次爬上平臺或被引上平臺后，讓其在平臺上休息10 s。記錄3次訓(xùn)練潛伏期的算術(shù)平均值作為學(xué)習(xí)成績。第4天撤除平臺，依次從B、C、D點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，觀測其在120 s內(nèi)平臺周圍活動軌跡長占總軌跡長的百分比。

1.3.2 海馬內(nèi)BDNFmRNA檢測Morris水迷宮檢測后，腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉1ml/100 g麻醉，開顱取腦，在冰盤上迅速剝離大鼠大腦雙側(cè)海馬，勻漿。根據(jù)Genbank發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)BDNF和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的引物和探針。上游引物：5'-CCA TAA GGA CGC GGA CTT GT-3'；下游引物：5'-GAG GCT CCA AAG GCA CTT GA-3'；探針：FAM-CAC TTC CCG GGT GAT GCT CAG CA-TAMRA。

使用經(jīng)典法RNA抽提試劑盒從海馬組織沉淀中抽提總RNA。采用核酸蛋白測定儀(Biophotometer，德國Eppendorf公司)檢測260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度。按照cDNA合成試劑盒以2μg RNA為模板合成cDNA，合成的cDNA-20℃儲存?zhèn)溆谩８鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)基因的拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示。水迷宮試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用多因素重復(fù)測量方差分析，不同組間的差異采用單因素方差分析。不同組間BDNFmRNA含量采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮 兩組大鼠Morris水迷宮潛伏期隨訓(xùn)練時(shí)間增多呈逐漸下降的趨勢。在第1天，兩組大鼠的潛伏期無顯著差異(P＞0.05)；第2天試驗(yàn)組大鼠的潛伏期低于對照組(P＜0.05)；第3天兩組潛伏期又無顯著差異(P＞0.05)。試驗(yàn)組大鼠第2、第3天的潛伏期均明顯低于第1天(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠潛伏期變化(s)

試驗(yàn)組大鼠平臺周圍活動軌跡長占總軌跡長的百分比為(9.82±1.09)%，高于對照組(5.98±1.10)%(t=4.25,P＜0.05)。

2.2 BDNFmRNA表達(dá) 兩組大鼠海馬缺血側(cè)BDNFmRNA表達(dá)量高于非缺血側(cè)(P＜0.05)。兩組大鼠非缺血側(cè)BDNFmRNA表達(dá)量無顯著性差異(P＞0.05)；試驗(yàn)組缺血側(cè)BDNFmRNA表達(dá)量明顯高于對照組(P＜0.01)。見表2。

表2 各組大鼠海馬組織BDNFmRNA表達(dá)

3 討論

大鼠MACO模型可較好地模擬臨床病理過程而常被使用。本研究中使用老齡大鼠MACO再灌注模型，觀察適量跑步運(yùn)動對大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶的影響。

Morris水迷宮主要用于測試實(shí)驗(yàn)動物對空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力。從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶儲存的機(jī)制主要涉及邊緣系統(tǒng)(如海馬)以及大腦皮層相關(guān)腦區(qū)[6-7]。本研究顯示，小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動可有效提高腦缺血再灌注大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

運(yùn)動對學(xué)習(xí)記憶的影響逐漸成為研究熱點(diǎn)。Kramer等研究顯示，從不運(yùn)動的老年人通過步行運(yùn)動，其思維能力如計(jì)劃、安排和工作記憶力都相對有所改善[8]。大量動物實(shí)驗(yàn)也表明，運(yùn)動有助于動物海馬等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元的增殖、存活和分化，促進(jìn)LTP的誘導(dǎo)，提高實(shí)驗(yàn)動物的空間記憶和被動逃避記憶能力[2]。

關(guān)于學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制，學(xué)者們已從神經(jīng)生理、神經(jīng)生化和神經(jīng)解剖等不同的角度進(jìn)行大量的研究，并形成了很多學(xué)說。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一。BDNF在大腦皮層、海馬等中樞神經(jīng)系統(tǒng)部位含量較豐富，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)多種類型神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、維持和損傷修復(fù)都具有重要作用，參與了腦缺血性損傷的保護(hù)過程[9-10]。

腦缺血后，BDNF及其受體TrkB表達(dá)均增加，長期腦缺血將導(dǎo)致缺血中心區(qū)神經(jīng)元壞死，但在梗死灶周圍“半暗帶”，甚至遠(yuǎn)離梗死灶的區(qū)域仍可見BDNFmRNA顯著表達(dá)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測海馬組織中BDNF表達(dá)，所得結(jié)果與前人研究一致，即腦缺血再灌注后，缺血側(cè)BDNFmRNA表達(dá)都多于非缺血側(cè)。

研究發(fā)現(xiàn)，數(shù)天的自主性轉(zhuǎn)輪運(yùn)動能使海馬神經(jīng)元BDNFmRNA和TrkB受體表達(dá)明顯增強(qiáng)，但并不能引起皮層BDNFmRNA和蛋白表達(dá)的變化[13-14]。可見運(yùn)動對BDNF的影響具有一定的組織區(qū)域特異性。但運(yùn)動對腦缺血再灌注大鼠海馬BDNF表達(dá)水平的影響未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動能提高腦缺血再灌注大鼠BDNFmRNA的表達(dá)。

近年來還發(fā)現(xiàn)，BDNF可能參與學(xué)習(xí)記憶的過程：BDNF可調(diào)節(jié)突觸傳遞，并參與突觸后LTP，其作用類似于神經(jīng)遞質(zhì)[15]。腦室內(nèi)注射抗BDNF抗體可使大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力明顯下降。提示BDNF可能是運(yùn)動促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力發(fā)送的介導(dǎo)因素之一。

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