艷 城 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020

通過飼料營養(yǎng)價值評定，可以了解和掌握各種動物對飼料養(yǎng)分的利用情況、需要量及其變化規(guī)律，為科學飼養(yǎng)奠定理論基礎(chǔ)。目前，評定飼料營養(yǎng)價值的方法主要有概略養(yǎng)分分析法、體內(nèi)法和體外法。概略養(yǎng)分分析法是評定飼料營養(yǎng)價值的一種常用方法，如總能、總磷、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維等的測定方法。但利用此法所得的飼料養(yǎng)分與動物消化吸收的養(yǎng)分之間存在很大差異，不足以準確地反映飼料的實際營養(yǎng)價值。體內(nèi)法是評定飼料在瘤胃內(nèi)降解率的直接方法。體內(nèi)法測定動物對飼料的采食量、消化率和利用率，并以此評估飼料的營養(yǎng)價值。然而，應(yīng)用傳統(tǒng)的體內(nèi)法來檢測飼料的消化率，實驗周期長、費用高，并且需要大量的樣品，不便于大規(guī)模進行。另外，由于實驗動物個體間差異較大，實驗結(jié)果可重復性較差，不利于測定方法的標準化。隨著動物消化生理研究的深入和技術(shù)手段的創(chuàng)新，利用動物體外消化模擬技術(shù)來研究飼料的營養(yǎng)價值已成為可能。因此人們建立了體外法來研究飼料的營養(yǎng)價值。體外法是借助生物學方法體外模擬動物消化過程估測飼料消化率。體外試驗技術(shù)因其操作方法較易掌握、實驗周期短、重復性好等特點得到了廣泛的應(yīng)用。在反芻動物飼料營養(yǎng)價值評定中采用的體外方法較典型的有：Tilley和Terry(1963)建立的兩步法 （兩級離體法）、體外產(chǎn)氣法（HFT技術(shù)）和體外連續(xù)培養(yǎng)法。

目前，應(yīng)用最廣泛的是Tilly和Terry（1963）提出的一步法和此后改進的兩步法（即兩級離體法）。它是將瘤胃液過濾后與待測飼料在厭氧環(huán)境、適宜的溫度（38℃～39℃）和 pH（6.7～6.9）等條件下共同培養(yǎng)48h后，再用瘤胃蛋白酶（pH大約為2）培養(yǎng)48h，以模擬飼料在瘤胃、真胃和部分小腸的消化過程。根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)管內(nèi)殘留物的分析結(jié)果，估測飼料消化率。測定飼料營養(yǎng)成分大多采用差值法。體外產(chǎn)氣法是Raab,L.等（1983）和德國荷恩海姆大學動物營養(yǎng)研究所Menke K.H等人建立的，是目前采用最多的用來評價飼料營養(yǎng)價值的方法之一。國外文獻多稱該方法為HFT技術(shù)。此方法是基于飼料樣品在體外用瘤胃液消化所產(chǎn)生氣體的比率來估計飼料消化率。飼料樣品的活體外經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體（C O2、CH4、H2）為微生物的代謝產(chǎn)物，因此，在一定的代謝途徑下，可以利用氣體產(chǎn)生的數(shù)量或速度反映營養(yǎng)物質(zhì)被瘤胃微生物發(fā)酵的程度和速度。消化率不同的各種飼料，在相應(yīng)的時間內(nèi)（一般為24h）產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣率不同。

本文針對利用兩步法和體外產(chǎn)氣法 （HFT技術(shù)）進行飼料的營養(yǎng)價值評定做進一步的概述，即采用瘤胃液對飼料進行體外培養(yǎng)，以達到近似于瘤胃內(nèi)發(fā)酵環(huán)境來評定飼料的營養(yǎng)價值。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

2011年3 月至2011年5月，內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)所。

1.2 試驗動物

營養(yǎng)所試驗基地的（具瘤胃瘺管的）絨山羊2只。

1.3 試驗材料

市售精補顆粒料，羊草由動物營養(yǎng)所試驗基地提供，試驗日糧為按表1配制的全混日糧。

瘤胃液采自裝有永久性瘤胃瘺管并飼喂精粗料比為40∶60飼糧的內(nèi)蒙古白絨山羊。

實驗試劑：緩沖液、胃蛋白酶溶液；培養(yǎng)液；0.2M鹽酸、工作液、A液、B液。

1.4 試驗方法

1.4.1 概略養(yǎng)分分析試驗方法

表1 全混日糧的配方

營養(yǎng)成分測定方法參照楊勝(1999)的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》。

干物質(zhì)（DM）：用105℃干燥法測定。

粗脂肪（EE）：采用 SZF-06A脂肪測定儀，將烘干后的樣品用濾紙包裹后由玻璃入口放入，再加乙醚，使之反應(yīng)。4h后取出樣品烘干稱重，計算出脂肪含量。

粗灰分(Ash)：茂福爐中550℃～600℃下灰化測定。取烘干后的樣品移入坩鍋碳化、灰化(600℃)至恒重；測定每批樣品的粗灰分重量。

粗蛋白(CP)：用凱氏半微量定氮法測定。取烘干后的樣品移入消化管進行消化，每份樣品中分別加入適量的催化劑和15m l的H2SO4后開始消化。消化完畢后，測定每批樣品的粗蛋白含量。

中性洗滌纖維(NDF)：取烘干后的樣品移入袋后按Van soest中性洗滌劑法測定。

非纖維性碳水化合物NFC%=100-(NDF%+CP%+Fat%+Ash%)

1.4.2 兩極離體試驗方法

首先在厭氧、39℃條件下,用瘤胃液的稀釋液消化1.5g底物樣品 （稱取樣品1.5g，放入培養(yǎng)瓶中，每管加入120m L的緩沖液混勻，通入CO2，直到其處于飽和狀態(tài)。放入培養(yǎng)箱中，使其溫度達到38℃，然后加入30m L瘤胃液，測定pH并通入CO2，，達到飽和。pH 應(yīng)保持在 6.7～6.9，利用 1mol/L的NaCO3來加以調(diào)整）放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,每天搖動2～3次。在培養(yǎng)開始后6小時和24小時測定pH值并進行調(diào)整。然后加入1m L 5%HgCl2,2m L1moL/L的NaCO3以抑制微生物的活動，促進沉淀，棄上清液。然后加入胃蛋白酶150m L在39℃、酸性條件（pH應(yīng)在1.5左右）下,消化48h。培養(yǎng)結(jié)束后,測定殘渣中的DM、CP和NDF含量,計算出DMD、CPD和NDFD含量。

1.4.3 體外產(chǎn)氣試驗方法

產(chǎn)氣量的測定：同時進行3個重復的培養(yǎng),將0.4000g待測樣品干物質(zhì)置于特制的150m L酸奶瓶中,用60m L瘤胃稀釋液(20m l瘤胃液+40m l培養(yǎng)液)消化。 記錄 1、2、3、6、8、12、24、36、48 各時間點的產(chǎn)氣量。采用Groot等(1996)描述的多相組合模擬模型gas(ml)=a1/(1+(k1/t))c1+……+an/(1+(kn/t))cn計算動態(tài)消化產(chǎn)氣參數(shù)。式中：Y為a代表每一飼料組分理論上的最大產(chǎn)氣量(ml)；k為對應(yīng)飼料組分達到最大產(chǎn)氣量一半時所需時間 ,h；而c是決定曲線形狀的參數(shù)；t為培養(yǎng)時間(h)。從產(chǎn)氣開始后，按照時間點記錄產(chǎn)氣量，每次記錄完進行放氣，使注射器的刻度為零，等下一次記錄完畢后又返回到零刻度。由于前幾個小時產(chǎn)氣較多，記錄時間稍微密集一點，以后間隔的時間稍長一點，以此減少試驗誤差。

活體外pH、NH3-N測定：在39℃、厭氧條件下,將0.2000g待測樣品干物質(zhì)置于特制的150m L酸奶瓶中,用30m L瘤胃稀釋液 (10m l瘤胃+20m l培養(yǎng)液)消化。每個培養(yǎng)設(shè)3個重復，待培養(yǎng)至24 h時立即測定發(fā)酵液pH（采用上海雷磁儀器廠產(chǎn)PHS-3B型高精度酸度計測定）,氨態(tài)氮含量測定參照馮宗慈等（1993）方法。

NH3-N測定方法為：依次量取工作液0、1、2、4、6m l置于5個編號的50m l容量瓶內(nèi)，接著依次加入蒸餾水 10、9、8、6、4m l， 使之成為 10m l。 再用0.2M鹽酸定容到刻度處，此系列標準溶液每100m l的含氮量依次為 0、0.2、0.4、0.8、1.2。 準確量取各標準溶液0.4m l分別置于5個10m l試管內(nèi)，各管內(nèi)依次加入A液2m l和B液2m l搖勻，靜置10分鐘后，用722分光光度計于波長700nm處比色，0.5cm的比色皿，用蒸餾水的0號試管作為空白對照，測定各溶液消光值(0號標液保存，測樣品時調(diào)零點用)。用消光值作為自變量、溶液含N量作為從變量導出回歸方程式。做出標線后，從培養(yǎng)液中取10m l于3500～4000r/m in下離心10m in，量取0.5m l上清液置于15m l試管內(nèi)，再加入9.5m l 0.2M鹽酸至10m l搖勻(稀釋倍數(shù)為20)，比色操作同上所述。把測得的消光值代入回歸公式，算得的結(jié)果再乘以樣品的稀釋倍數(shù)即為原樣品中的氨氮含量。

1.5 試驗目的

本試驗采用的日糧1為羔羊開口料，日糧2為羔羊育肥料。

在飼養(yǎng)羔羊的過程中，羔羊提前補飼可以促進前胃的發(fā)育，增加羔羊營養(yǎng)來源，提高羔羊安全越冬能力，一般羔羊從10日齡開始到斷奶前都需進行補飼。補飼前期用開口料飼喂槽羔羊。這個階段是羔羊由吃母乳逐漸到采食草料的過渡時期，從開始補飼到6周齡以母乳為主，補飼開口料為輔。6周齡到斷奶期間以補飼育肥料為主，母乳為輔，在補飼中逐漸增加優(yōu)質(zhì)干草與精補料的數(shù)量，減少母乳的飼喂量。

羔羊開口料和羔羊育肥料都要求具有全面的營養(yǎng)以及在消化道內(nèi)易消化降解，因此本試驗利用概略養(yǎng)分分析、兩級離體和體外產(chǎn)氣試驗等來綜合評價兩種日糧的營養(yǎng)價值。

2 結(jié)果與分析

2.1 概略養(yǎng)分分析結(jié)果

表2 不同比例全混日糧營養(yǎng)成分

圖1 不同比例全混日糧營養(yǎng)成分

從圖1可以看出兩種不同比例全混日糧的營養(yǎng)成分，其中1號樣品中的三大營養(yǎng)物質(zhì)粗蛋白、粗脂肪和碳水化合物的含量較高。

2.2 兩級離體實驗結(jié)果

表2 全混日糧DM消化率、CP消化率、NDF消化率

圖2 全混日糧DM消化率、CP消化率、NDF消化率

由上圖可以看出，不同比例全混日糧的消化率均為1號樣品的高。

2.3 體外產(chǎn)氣實驗結(jié)果

表3 不同比例全混日糧體外產(chǎn)氣量

圖3 不同比例全混日糧體外產(chǎn)氣量

由圖3可知，前3h兩個樣品的差距不大，3～24h內(nèi)1號樣品的產(chǎn)氣量明顯高于2號樣品的產(chǎn)氣量，而24h后產(chǎn)氣量極少。

表4 不同比例全混日糧產(chǎn)氣曲線

圖4 不同比例全混日糧產(chǎn)氣曲線

由圖4可以看出，兩種日糧最大產(chǎn)氣量分別為91.194（ml）、92.737（ml）。從不同發(fā)酵參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系可以看出,在發(fā)酵時間比較短的情況下,理論最大產(chǎn)氣量受產(chǎn)氣速率及延滯時間的影響。而產(chǎn)氣速率與主要營養(yǎng)成分的含量之間存在著極顯著的相關(guān)性。

圖5 NH3-N標線

由圖5可知，標線y=1.094x-0.022（y：濃度，x：吸光度，原樣稀釋倍數(shù)為20倍）。

表5 NH3-N的濃度

由表5可以看出，1號樣品的氨氮濃度明顯高于2號樣品。

表6 pH值的測定

由表6可以看出，兩個樣品間pH值差距不大，和絨山羊瘤胃內(nèi)環(huán)境相差不大，均處于正常生理范圍(pH值5.5～7.5)內(nèi),不會影響瘤胃的發(fā)酵功能。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

（1）不同精粗比日糧對消化率的影響

兩級離體技術(shù)測定的結(jié)果（表2）顯示，不同精粗比的飼料其消化率也不同，相對而言1號精補料的消化率比2號精補料的消化率高一些，差異不顯著。其粗蛋白的消化率最明顯，NDF在瘤胃的消化率是1號樣品高于2號樣品。這說明，消化率受粗蛋白質(zhì)的影響，飼料中粗蛋白含量越高其消化率越高。高含量的NDF會降低微生物對全混日糧的降解速率,從而延緩發(fā)酵的啟動。然而，當日糧中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物或易發(fā)酵物質(zhì)的含量較高時,微生物會利用降解產(chǎn)物迅速繁殖,從而提高消化率。

（2）不同精粗比日糧對產(chǎn)氣量的影響

一般來說，產(chǎn)氣量是反映底物中碳水化合物組分被瘤胃微生物利用程度的標志。體外產(chǎn)氣法發(fā)酵后的主要產(chǎn)物為CO2、CH4和VFA。然而,VFA在被緩沖劑中和后也會產(chǎn)生少量的氣體。因此,可以說產(chǎn)氣量反映了底物發(fā)酵。產(chǎn)氣量多，說明底物中碳水化合物組分含量高或被利用的比例大；產(chǎn)氣量少則反之。然而，在底物粗蛋白含量不同的條件下，瘤胃微生物產(chǎn)氣量的高低不能完全反映底物被利用的程度。Picard等曾報道，當?shù)孜锏鞍踪|(zhì)含量高時，底物的DMD明顯提高，但底物的發(fā)酵產(chǎn)氣量明顯減少。

本試驗利用體外產(chǎn)氣法研究了2種不同全混日糧的營養(yǎng)價值。從圖中可以看出，前3h 1號日糧和2號日糧的產(chǎn)氣量差距不太明顯，而3～24h的產(chǎn)氣量1號日糧明顯高于2號日糧，24h以后2號日糧的產(chǎn)氣量比1號日糧的高?？偟膩碚f，1號日糧的產(chǎn)氣量均高于2號日糧。在瘤胃中，2種不同比例全混日糧發(fā)酵參數(shù)不同，可以說，在瘤胃中被消化吸收的程度不同。精飼料本身較易被動物的瘤胃液消化。不同比例全混日糧的最大產(chǎn)氣量為91.194、92.737。從不同發(fā)酵參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系可以看出,在發(fā)酵時間比較短的情況下,理論最大產(chǎn)氣量受產(chǎn)氣速率及延滯時間的影響。而產(chǎn)氣速率與主要營養(yǎng)成分的含量之間存在著極顯著的相關(guān)性,由此可以推斷其通過營養(yǎng)成分對底物發(fā)酵速率起到促進或抑制作用。

（3）不同精粗比日糧對瘤胃氨氮濃度的影響

NH3-N是飼料蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、氨化物、尿素和其它非蛋白質(zhì)氮化合物分解的終產(chǎn)物,同時又是微生物合成菌體蛋白的原料,其濃度反映的是飼料中蛋白質(zhì)的降解情況。瘤胃NH3-N濃度在一定程度上反了特定日糧組成下蛋白降解與合成間所達到的平衡狀態(tài)。由表4可知兩試驗組氨氮濃度范圍是 6.56～25.33mg/100m L，處于已報道的最佳NH3-N濃度 (6.3～27.5 mg/100m l)范圍之內(nèi)（Murphy 等，1987；Ortega 等，1979）。 所以，本試驗中兩種精粗比日糧均使瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生了適當?shù)腘H3-N濃度。本試驗表明，添加不同日糧會直接影響飼料蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解。

（4）不同精粗比日糧對瘤胃pH值的影響

瘤胃碳水化合物發(fā)酵的主要產(chǎn)物是乙酸、丙酸和丁酸等VFA，它們是反芻動物主要的能量來源及合成乳脂和體脂的原料。VFA濃度在很大程度上影響瘤胃的pH值，而反過來瘤胃pH值對瘤胃微生物群落也有重要影響。pH值是反應(yīng)瘤胃發(fā)酵情況的發(fā)酵水平的綜合指標，在1和2試驗組中，瘤胃pH值的范圍是6.43～6.52，處于Murphy等(1987)所報道的正常范圍內(nèi)。表明兩組日糧條件下瘤胃均處于正常發(fā)酵狀態(tài)。正常的瘤胃發(fā)酵pH值范圍,驗證了試驗是在正常的發(fā)酵環(huán)境中進行的,同時也證明了試驗數(shù)據(jù)的可靠性。

3.2 結(jié)論

從結(jié)果可知，1號樣品的消化率均高于2號樣品，而體外產(chǎn)氣量也表明1號樣品的產(chǎn)氣量比2號的高。在pH值正常的發(fā)酵情況下氨氮濃度也是1號樣品的高于2號樣品?？梢哉f不同比例的全混日糧在瘤胃中的消化和利用率不同，營養(yǎng)價值也有所不同。

然而，體外培養(yǎng)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于反芻動物營養(yǎng)研究,得益于其技術(shù)簡便、費用低,以及相應(yīng)測定裝置的發(fā)展。但是，目前仍缺少對不同實驗室之間的試驗比較,各個實驗室之間的數(shù)據(jù)往往無法比較。同時,各個實驗室采用的具體的技術(shù)細節(jié)和裝置不同,難以制定統(tǒng)一的標準化程序。此外,作為一種動物消化模擬技術(shù)關(guān)鍵在于與體內(nèi)環(huán)境相似,所以本實驗只給飼料營養(yǎng)價值評定中提供理論依據(jù)。

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