李公美，李玉梅，胡靜濤，劉可越，錢愛東

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062；3.江西九江學(xué)院，江西 九江 332000）

干擾素（IFN）是體內(nèi)一種重要的干擾病毒繁殖的免疫活性細(xì)胞因子，由Isaacs等［1］在研究雞胚絨毛尿囊膜中禽流感病毒時(shí)首次發(fā)現(xiàn)。Ⅰ型干擾素主要由病毒和微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生，Ⅱ型干擾素主要由淋巴細(xì)胞受有絲分裂原或特異性抗原刺激產(chǎn)生，IFN-α可抑制感染細(xì)胞中病毒mRNA翻譯，并促使病毒mRNA降解，能提高細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達(dá)水平，有助于向T細(xì)胞遞呈抗原，引起靶細(xì)胞的溶解，并可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)病毒的殺傷能力［2］。

20世紀(jì)80年代以來，人的干擾素基因［3］克隆表達(dá)成功后應(yīng)用到了臨床，獲得了抗病毒的顯著效果，隨后，狗［4］、豬［5］干擾素基因也相繼被克隆，近年來，Digby［6］、Sick和夏春等［7］報(bào)道了雞IFN 序列。Schultz等［8］報(bào)道了鴨IFN序列，并開展了其抗病毒的研究。但目前關(guān)于鵝IFN的報(bào)道較少，養(yǎng)鵝業(yè)是我國養(yǎng)殖業(yè)中重要的支柱產(chǎn)業(yè)，鵝絨、鵝羽都是貴重的出口商品，在國際上非常受歡迎，目前我國在客觀上急需大力發(fā)展養(yǎng)鵝業(yè)。鵝細(xì)小病毒、鵝副黏病毒等感染是危害養(yǎng)鵝業(yè)最嚴(yán)重的大敵。但目前該類疾病的防治相對(duì)落后，而且雞、鴨等禽類IFN藥物已經(jīng)投入生產(chǎn)使用，因此加強(qiáng)鵝IFN的研究顯得尤為重要，本試驗(yàn)參照有關(guān)鴨等禽類IFN的報(bào)道，無菌取鵝肝臟，利用動(dòng)物基因組試劑盒提取鵝肝臟中的總DNA，采用PCR技術(shù)，成功克隆獲得吉林白鵝IFN-α基因，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)、純化，檢測其抗病毒活性，為進(jìn)一步研究吉林白鵝IFN抗病毒作用機(jī)制及研制防治鵝病毒性疾病的新型制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒與毒株 含吉林白鵝IFN-α基因的重組質(zhì)粒pMD-T-IFN-α由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，鴨瘟病毒由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，E.coli BL21（DE3）、pGEX-6p-1由吉林大學(xué)獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、Eco RⅠ、Taq DNA聚合酶及T4DNA連接酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司；GST融合蛋白純化試劑盒為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品，低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為北京天根有限公司產(chǎn)品；IPTG、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒為杭州維特潔生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；酵母浸出粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清購自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與目的基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)Gen-Bank上已發(fā)表的鵝IFN-α序列（登錄號(hào)：HQ00-9755），用Primer 5.0軟件在其完整的閱讀框架外設(shè)計(jì)上、下游引物，引物序列分別為P1：5′-ATAAACATGCCTGGGCCATCAG-3′ P2：劃線部分分別為Bam HⅠ和Eco RⅠ 酶切位點(diǎn)，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 鵝IFN-α基因的PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收 以重組質(zhì)粒pMD-T-IFN-α為模板，PCR擴(kuò)增IFN-α，PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為：ddH2O 37.5 μL、10×PCR Buffer 5μL、mix dNTPs（10mmol／L）1μL、IFN-αP1（20pmol／L）／IFN-αP2（20pmol／L）各1μL、重組質(zhì)粒 GoIFN-α（0.5mg／mL）1μL、Ex Taq酶（5μ／μL）0.5μL，補(bǔ)超純水至50μL，混勻。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性8min，94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定反應(yīng)產(chǎn)物，用凝膠回收純化試劑盒回收目的片段。

1.5 重組表達(dá)載體pMD-IFN-α的構(gòu)建 用Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切含鵝IFN-α基因T載體，插入到同樣經(jīng)Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切的pGEX-6p-1表達(dá)載體的大片段中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEXIFN-α。轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和Bam HⅠ、Eco RⅠ酶切鑒定，對(duì)初步篩選出的陽性克隆送至寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.6 重組質(zhì)粒pGEX-IFN-α的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-IFN-α轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21中，挑單個(gè)菌落接種于5mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r／min搖床培養(yǎng)。帶菌液OD值為0.6～1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0mmol／L，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6h后收集菌體，同時(shí)設(shè)只含表達(dá)載體pGEX-6p-1的BL21和誘導(dǎo)后pGEX-6p-1的BL21對(duì)照。將誘導(dǎo)表達(dá)菌裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot。

1.7 重組鵝IFN-α的純化 根據(jù)谷胱苷肽瓊脂糖-4B（Glutathione Sepharose-4B）操作說明書純化GST融合蛋白：（1）將谷胱甘肽瓊脂糖-4B基質(zhì)轉(zhuǎn)移至一次性的小柱子。（2）輕扣小柱以除氣泡，然后讓谷胱甘肽瓊脂糖-4B基質(zhì)著床。（3）移去底蓋。（4）加入10倍體積的1×PBS洗滌2次。（5）在基質(zhì)中每次加入100μL GST Reduction Elution Buffer洗脫GST融合蛋白。（6）收集洗脫液。用SDSPAGE電泳檢查純化蛋白的純度，用薄層掃描儀進(jìn)一步掃描分析目的蛋白純度。蛋白經(jīng)純化后，用紫外分光光度計(jì)測定樣品在波長260nm和280nm處的OD值，按照公式計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。計(jì)算公式為：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg／mL）＝（1.45×OD280-0.74×OD260）稀釋倍數(shù)。

1.8 定量PCR檢測重組鵝IFN-α抗病毒活性的測定 制備鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF），待鴨胚成纖維細(xì)胞長成單層后分3組：DPV感染細(xì)胞陽性對(duì)照組、BL21（DE3）／pGEX空載體培養(yǎng)物處理的DPV感染細(xì)胞對(duì)照組和保護(hù)組（加入含2μg／mL重組鴨IFN-α處理18h后感染DPV），DPV強(qiáng)毒的感染量為100PFU。在接毒1h、5h、10h、15h、23h、32h、40h、48h、55h、63h每組分別取2瓶凍存。試驗(yàn)重復(fù)4次，每次間隔7d。按文獻(xiàn)［9］用定量PCR檢測DPV強(qiáng)毒。每日置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞病變情況，即能看到引起病毒增殖的最高稀釋度，依據(jù)Reed-Muench法［10］，計(jì)算其鴨瘟病毒的TCID50，采用微量中和試驗(yàn)測定GoIFN-α的抗病毒效價(jià)［11］。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1的鑒定 對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-6p-1進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果在約570bp處得到了1條目的條帶；用Bam HⅠ和Eco RⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，分別在約4900bp和約570bp處出現(xiàn)1條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。將經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序，測序結(jié)果與鵝IFN-α全基因的編碼序列完全一致。

2.2 重組鵝IFN-α基因的表達(dá)及鑒定 SDSPAGE電泳結(jié)果顯示，含有重組質(zhì)粒pGEX-IFN-α的重組菌液出現(xiàn)1條約為43.0ku的融合蛋白（GST-IFN-α）與預(yù)期結(jié)果相一致；而只含表達(dá)載體pGEX-6P-1的BL21，在26.0ku處有1條明顯的蛋白帶（GST）；未含重組質(zhì)粒和表達(dá)載體的宿主菌BL21，沒有出現(xiàn)這一條帶（圖2）。表明重組質(zhì)粒pGEX-IFN-α在BL21中可誘導(dǎo)表達(dá)重組鵝α干擾素融合蛋白。薄層掃描分析結(jié)果顯示，表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的18.6%。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素（NC）上，用GST單抗作一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗鼠IgG作二抗進(jìn)行Western-blot檢測。結(jié)果（圖3）顯示，融合蛋白43.0ku出現(xiàn)一條特異條帶，同時(shí)表達(dá)空載體在26.0ku處出現(xiàn)一條帶，因此根據(jù)分子質(zhì)量的大小推測，這條帶的相對(duì)分子質(zhì)量與目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量相同，表明誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白是重組的鵝α干擾素。

2.3 重組鵝IFN-α的抗DPV強(qiáng)毒活性 定量PCR檢測重組鵝IFN-α不同時(shí)間抗DPV強(qiáng)毒的結(jié)果（圖4）。在感染后15h內(nèi)，重組鵝IFN-α組與DPV感染細(xì)胞對(duì)照組和BL21（DE3）／pGEX空載體培養(yǎng)物對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），病毒核酸拷貝數(shù)均在105.6～105.2間；從23h開始，鵝IFN-α保護(hù)組的核酸拷貝數(shù)低于陽性對(duì)照組并在感染后47～55h其拷貝數(shù)差異達(dá)到最大，差異顯著（P＜0.05）。55h時(shí)，與陽性對(duì)照組的DPV拷貝數(shù)相比，鵝IFN-α保護(hù)組能減少病毒108.54個(gè)核酸拷貝數(shù)，相對(duì)抑制率80%；DPV感染細(xì)胞對(duì)照組和空載體培養(yǎng)物對(duì)照組各時(shí)間段病毒的增殖趨勢和核酸拷貝數(shù)基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖4 定量PCR檢測重組pGEX-IFN-α抗DPV強(qiáng)毒效果

3 分析與討論

因本試驗(yàn)做克隆與序列分析時(shí)經(jīng)比對(duì)鵝IFN-α與鴨IFN-α同源性為97.2%，因此為探討鵝IFN-α應(yīng)用于生產(chǎn)的可能性，本試驗(yàn)選用了對(duì)我國養(yǎng)鴨業(yè)危害最為嚴(yán)重的傳染病之一的DPV強(qiáng)毒為重組IFN-α抗病毒活性的研究對(duì)象，同時(shí)采用具有高度敏感和特異性的FQ-PCR技術(shù)來檢測重組IFN-α對(duì)DPV的動(dòng)態(tài)干擾效果。這樣不但可以避免傳統(tǒng)方法［12-13］。

受非特異性因素的各種影響（如干擾素本身可以影響多數(shù)細(xì)胞的分裂等），客觀的反映了干擾素對(duì)病毒復(fù)制的抑制效果。DPV感染DEF的最初15 h，病毒處于靜止期，各試驗(yàn)組差異不顯著；隨后DPV復(fù)制開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，重組鵝IFN-α抗DPV組的病毒核酸拷貝數(shù)低于不加鵝IFN-α的陽性對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；陽性組中的DPV在55h附近達(dá)到復(fù)制高峰，到63h后由于細(xì)胞老化會(huì)被破壞，病毒量有所減少，而重組鵝IFN-α保護(hù)組中病毒增殖期明顯較陽性組慢，在63h時(shí)仍未達(dá)到陽性組在55h的含病毒量。因此重組鵝IFN-α對(duì)DPV的復(fù)制有明顯的抑制效果，能抑制DPV強(qiáng)毒在DEF上形成空斑。由于鵝IFN-α是通過抑制病毒核酸的合成達(dá)到抗病毒效果，其抗病毒機(jī)理與中和抗體不同，具有光譜性。

干擾素作為一種抑制和干擾病毒繁殖的可溶性細(xì)胞因子，可刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白質(zhì)，阻斷病毒的繁殖，當(dāng)干擾素系統(tǒng)被激活后，細(xì)胞接觸干擾素只需幾分鐘，就產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)，動(dòng)物可在1～3周時(shí)間內(nèi)對(duì)其他病毒的重復(fù)感染也有抵抗作用［14］，雖然病毒性疾病能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生少量干擾素，在體內(nèi)抑制病毒的增殖，但因表達(dá)量低，所以難以保護(hù)機(jī)體抵抗疾病的侵襲，因此我們希望能通過基因工程方法規(guī)模化獲得鵝重組干擾素應(yīng)用到臨床。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究鵝IFN-α在抗病毒、抗腫瘤等方面的作用及鵝IFN生物制劑的研究奠定了基礎(chǔ)。

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