歐陽樂，王振宇，2＊

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090）

近年來，有越來越多的動(dòng)植物及食藥用真菌來源的活性寡糖及其衍生物被開發(fā)應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、保健品、飼料添加劑、農(nóng)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，并不斷發(fā)現(xiàn)一些寡糖成分的新功能［1－4］。目前我國“富貴病”人數(shù)量明顯增多，心血管疾病在我國的發(fā)病率和死亡率明顯提高。經(jīng)研究表明，黑木耳多糖、寡糖作為重要的生物活性物質(zhì)，具有多種生物功能。而黑木耳多糖經(jīng)過降解后，形成數(shù)目巨大的木耳寡糖。而且黑木耳寡糖分子鏈短、水溶性極強(qiáng)，活性優(yōu)于多糖。β－葡萄糖苷酶已經(jīng)應(yīng)用于多糖的降解中，本項(xiàng)研究為將來開發(fā)功能性食品以及藥物提供了理論基礎(chǔ)［9］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑木耳、3，5－二硝基水楊酸（北京鎢信精細(xì)制劑廠）、檸檬酸、磷酸氫二鈉、β－葡萄糖苷酶（上?？笊锛夹g(shù)有限公司）。

DNS試劑的配制［15］：稱取3.25g 3，5－二硝基水楊酸溶于少量水中，移入500mL容量瓶，加2mol／L氫氧化鈉溶液162.5mL，再加入22.5g丙三醇，搖勻，定容至500mL，儲(chǔ)存于棕色瓶放置在冰箱中待用。

β－葡萄糖苷酶：精確稱取β－葡萄糖苷酶0.0050g溶于少量pH值為5的磷酸－檸檬酸緩沖溶液中，定容于25mL容量瓶中。4℃冷藏。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；粉碎機(jī)；電子分析天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；離心機(jī)；精密pH計(jì)；紫外分光光度計(jì)；真空冷凍干燥機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［13－14］

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 mL

準(zhǔn)確稱取干燥后的葡萄糖0.5000g，用蒸餾水溶解并定容至500mL容量瓶中。按表1進(jìn)行配置，充分混勻后于沸水浴5min。冷卻后加入蒸餾水2mL，混勻。以管1為空白對(duì)照，540nm波長下測吸光度。繪制吸光度－葡萄糖濃度曲線。

1.3.2 酶對(duì)黑木耳多糖的降解

1.3.2.1 β－葡萄糖苷酶用量對(duì)降解多糖釋放還原糖量的影響。取7個(gè)具塞試管每管加入2.4mL多糖溶液，依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mLβ－葡萄糖苷酶溶液，剩余用緩沖溶液補(bǔ)上，在保證多糖濃度為0.3%，pH值為5.0，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)1h后立即加入1.5mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10min后，冷卻，加入5mL緩沖溶液。以第一組未加酶的管為空白樣在540nm條件下測定其吸光度值，平行3次。

1.3.2.2 溫度對(duì)β－葡萄糖苷酶降解多糖釋放還原糖量的影響。取7個(gè)具塞試管每管加入2.6mL多糖溶液以及0.4mL酶溶液，分別置于40、45、50、55、60、65、70℃的熱水中，確保多糖濃度為0.3%，pH值為5.0，反應(yīng)時(shí)間為1h。反應(yīng)結(jié)束后立即加入1.5mL DNS試劑，沸水浴10min后冷卻，每管加入2mL緩沖溶液?？瞻讟訛橹患尤刖彌_溶液的多糖溶液，然后在540nm條件下測定其吸光度值，平行3次。

1.3.2.3 pH值對(duì)β－葡萄糖苷酶降解多糖釋放還原糖量的影響。取7個(gè)具塞試管，每管加入pH值從4到7不同的多糖溶液2.6mL以及0.4mL酶溶液，確保多糖濃度為0.3%，溫度為55℃，酶用量為0.4mL。反應(yīng)1h后立即加入1.5mL DNS試劑終止反應(yīng)，然后沸水浴加熱10min，冷卻后加入2mL緩沖溶液。空白樣為只加入相應(yīng)pH值的0.3%多糖緩沖溶液，每個(gè)pH值設(shè)置一個(gè)，在540nm條件下測定其吸光度值，平行3次。

1.3.2.4 時(shí)間對(duì)β－葡萄糖苷酶降解多糖還原糖釋放量的影響。配制濃度為0.3% 、pH值為5.5、加酶量為0.4mL的多糖溶液3mL，在反應(yīng)溫度為55℃時(shí)。反應(yīng)后在10、20、30、60、90、120min時(shí)取樣立即加入DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10min后，冷卻后加入2mL pH值為5.5的緩沖溶液?？瞻讟訛榧尤朊负罅⒓醇尤?.5mL DNS試劑，沸水浴處理10min的樣品。然后在540nm下測定其吸光度值，平行3次。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化降解條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以降解溫度、pH值、酶用量3個(gè)因素為自變量，還原糖的釋放量為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，使用MINITABL16軟件，根據(jù)Box－Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法對(duì)β－葡萄糖苷酶對(duì)黑木耳多糖的條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制圖

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

從圖1中可得葡萄糖的濃度與吸光度值之間的關(guān)系為：溶液中還原糖質(zhì)量（x）＝（吸光度（y）－0.002）／1.633，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999符合要求。表明葡萄糖在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于還原糖的定量測定。

2.2 酶用量對(duì)β－葡萄糖苷降解效果的影響

圖2 酶用量對(duì)β－葡萄糖苷降解效果的影響

從圖2可以看出當(dāng)酶用量為0.4mL時(shí)，隨著酶用量的增加而增加，到達(dá)0.4mL時(shí)還原糖的釋放量達(dá)到了最大。此后隨著酶用量的增加還原糖的釋放量不再增多，從以上分析得出當(dāng)0.3%的多糖與0.2g／mL的β－葡萄糖苷酶的體積比為15∶2時(shí)酶降解達(dá)到飽和值。

2.3 溫度對(duì)β－葡萄糖苷酶降解效果的影響

圖3 溫度酶降解效果的影響圖

由圖3可知，當(dāng)多糖濃度為0.3%，pH值為5.0時(shí)，β－葡萄糖苷酶的降解黑木耳多糖的最適降解溫度為55℃。在40～55℃之間隨著溫度的增高還原糖的釋放量酶活性不斷加大不斷增大，在55℃時(shí)達(dá)到了最大值，在55～70℃之間隨著溫度的不斷升高，酶不斷失活，還原糖的釋放量也不斷減少。

2.4 pH值對(duì)β－葡萄糖苷酶降解效果的影響

圖4 pH值酶降解效果的影響圖

由圖4可知，當(dāng)多糖濃度為0.3%，反應(yīng)溫度為55℃，酶用量為0.4mL時(shí)。當(dāng)降解體系的pH值為5.5時(shí)β－葡萄糖苷酶對(duì)黑木耳多糖的降解達(dá)到了最大。在pH值在4～5.5之間時(shí)還原糖的釋放量隨pH值的增大而增大，在pH值5.5時(shí)達(dá)到最大值，在5.5～6.5時(shí)隨pH值的增大還原糖的釋放量降低。

2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)β－葡萄糖苷酶降解效果的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶降解效果的影響圖

由圖5可知，β－葡萄糖苷酶對(duì)黑木耳多糖的降解時(shí)間非常的短，從反應(yīng)開始到20min還原糖的釋放量隨時(shí)間的增加基本上呈直線增大。20min此后隨著時(shí)間的增加降解趨于平緩還原糖的釋放量也不再增加，因此選擇20min比較的經(jīng)濟(jì)。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化降解條件結(jié)果

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

表4 響應(yīng)面回歸模型方差分析

根據(jù)表1安排試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果回歸擬合所得回歸模型如下：

由表3、4可知，決定系數(shù)R2＝98.96%，響應(yīng)面回歸模型高度顯著（P＝0.000），模型失擬項(xiàng)（P＝0.063），不顯著，說明該二次模型可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

圖6 Y＝f（X2，X3）的響應(yīng)面與等高線

圖7 Y＝f（X1，X3）的響應(yīng)面與等高線

圖8 Y＝f（X1，X2）的響應(yīng)面與等高線

由圖6、7、8可知，酶的用量對(duì)β－葡萄糖苷酶降解黑木耳多糖的影響最大。溫度和pH值影響較小。依據(jù)回歸模型的數(shù)學(xué)分析并綜合響應(yīng)圖確定降解的最佳工藝參數(shù)為：降解溫度55.9℃，pH值為5.58，酶用量為0.475mL?；貧w模型預(yù)測的得率理論值為0.1948。取溫度55.9℃，pH 值為5.58，酶用量為0.475mL，試驗(yàn)重復(fù)3次。3次平行試驗(yàn)的OD值分別為0.195，0.192和0.198，平均為0.195，與理論預(yù)測值相比相對(duì)誤差為0.03%，可見該模型能較好地模擬和預(yù)測β－葡萄糖苷酶對(duì)于黑木耳多糖的降解效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究酶法對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行降解，運(yùn)用了DNS法測定還原糖的釋放量作為研就究指標(biāo)，并用響應(yīng)面法進(jìn)行了優(yōu)化。得出了最佳的降解工藝。結(jié)論如下：最佳的降解工藝為多糖濃度為0.3%，溫度55℃、pH值5.5、反應(yīng)時(shí)間20min，每3mL多糖加入0.02%葡萄糖苷酶0.4mL時(shí)。響應(yīng)面優(yōu)化后，得出最佳工藝條件為：降解溫度55.9℃、pH值5.58、酶用量0.475mL。通過本文研究分析得出，酶法降解反應(yīng)后降解產(chǎn)物具有分子量分布窄、均一性好等優(yōu)點(diǎn)。該研究結(jié)果為將來制備黑木耳多糖寡糖、小分子黑木耳多糖在醫(yī)學(xué)、功能性食品開發(fā)等方面的應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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