盧莉莉 程 涇 浙江省溫州中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖中心 溫州 325014

程 蕾 黃 鵬 浙江省溫州市鹿城中山醫(yī)藥保健研究所

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是以長期無排卵及高雄激素為特征的內(nèi)分泌綜合征，也是生育期婦女月經(jīng)失調(diào)和無排卵不孕患者最常見的原因[1]。近年來，瘦素（Lep）、瘦素受體（OB-R）及胰島素樣生長因子I受體（IGF-IR）在PCOS發(fā)生發(fā)展中的作用已逐漸受到重視。益腎導(dǎo)痰調(diào)沖湯是程涇教授的經(jīng)驗方，本實驗觀察該方對多囊卵巢綜合征大鼠瘦素及其受體和胰島素樣生長因子I受體（IGF-IR）表達的影響。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF級雌性SD大鼠70只，21日齡，體質(zhì)量（50±10）g，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供和飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（浙）2005-0061。

1.2 藥 物 丙酸睪酮注射液（規(guī)格：1 mL/25 mg，天津金耀氨基酸有限公司）；注射用絨促性素（規(guī)格：1000U/支，麗珠集團麗珠制藥廠）；桂枝茯苓丸（規(guī)格：每100丸重10 g，山西華康藥業(yè)股份有限公司）；達英-35（規(guī)格：每片含醋酸環(huán)丙孕酮2 mg和炔雌醇0.035 mg，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）；益腎導(dǎo)痰調(diào)沖湯（由仙靈脾、菟絲子、杞子、膽南星、白芥子、法半夏、石菖蒲、水蛭、海藻、山慈菇、丹參、香附、茺蔚子等組成，規(guī)格：100 mL/袋，每毫升含生藥2.3 g，由溫州中山醫(yī)院中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)不孕不育研究所提供）。

1.3 試 劑 FSH、LH、T、E2放射免疫試劑盒購自上海史瑞可生物技術(shù)有限公司；瘦素ELISA試劑盒、OB-R、IGF-IR免疫組化試劑盒及SABC二抗試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模及分組 70只SD大鼠隨機分為病理模型組57只，正常對照組13只。病理模型組大鼠每天頸背部皮下注射HCG 5U，隔日注射丙酸睪丸酮1.25mg；正常對照組給予生理鹽水0.05mL，給藥第21天處死正常組大鼠3只和病理模型組大鼠7只評價造模效果。鏡下觀察正常對照組卵巢組織卵泡數(shù)目較少，并可見成熟卵泡和黃體。病理組卵巢組織內(nèi)均可見多個細小卵泡和閉鎖卵泡，無成熟卵泡，提示造模成功。其余60只再隨機分為正常對照組、模型組、中藥組、達英-35組、達英加中藥組、桂枝茯苓丸組，每組10只。

2.2 給 藥 中藥組給予等效劑量益腎導(dǎo)痰調(diào)沖湯23.96 g/（kg·d）灌胃（按人鼠體質(zhì)量比換算相當(dāng)于成人用藥量的6.25倍），共14天；達英-35組給予等效劑量達英-35 0.21 g/（kg·d）灌胃，共14天；達英加中藥組給予益腎導(dǎo)痰調(diào)沖湯23.96 g/（kg·d）+達英-35 0.21 g/（kg·d）灌胃（中西藥灌胃間隔時間30 min），共14天；桂枝茯苓丸組給予等效劑量桂枝茯苓丸0.42g/（kg·d）灌胃，共14天；正常對照組和模型組均給予同容積生理鹽水，共14天。

2.3 標本采集 大鼠處死前禁食水6h，測量大鼠體質(zhì)量，2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部剪毛，常規(guī)消毒，打開胸腹腔，心臟取血，3000 r/min離心，分離血清，-20℃保存。

2.4 檢測指標及方法 血FSH、LH、E2、T采用放射免疫法測定；lep采用ELISA法測定；精確切取雙側(cè)卵巢，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，采用免疫組化SABC法檢測卵巢組織OB-R、IGF-IR表達。結(jié)果判斷：顯色呈棕黃色顆粒為陽性表達。正常對照組和模型組卵巢組織顆粒細胞及卵泡膜細胞均可見OB-R、IGF-IR陽性表達。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，用均數(shù)±標準差（±s）表示。多組樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗和單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnet,sT3檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 卵巢組織形態(tài)學(xué)改變 正常對照組卵巢包膜厚薄均一，卵巢內(nèi)可見竇狀卵泡發(fā)育及成熟卵泡，個別可見排卵征。模型組卵巢色澤蒼白，體積明顯增大或縮小，卵巢表面呈明顯多囊樣改變，包膜明顯增厚。卵巢內(nèi)可見多個細小卵泡發(fā)育，未見成熟卵泡及排卵征。中藥組、達英-35、達英加中藥組、桂枝茯苓丸組大鼠卵巢較模型組色澤紅潤，體積偶有增大或縮小，卵巢表面偶有多囊樣改變。閉鎖卵泡數(shù)目明顯較模型組減少。中藥組、桂枝茯苓丸組卵巢內(nèi)可見竇狀卵泡及成熟卵泡，部分可見排卵征，中藥組較桂枝茯苓丸組好，接近于正常對照組。達英-35組、達英加中藥組無成熟卵泡發(fā)育。

3.2 用藥前后體質(zhì)量變化 治療前各模型組大鼠體質(zhì)量明顯高于正常對照組（P＜0.05）。治療后，各實驗組大鼠體質(zhì)量均有不同程度增加，中藥組、達英-35、達英加中藥組、桂枝茯苓丸組大鼠體質(zhì)量增長幅度明顯小于模型組（P＜0.05）；達英加中藥組、中藥組較達英-35、桂枝茯苓丸組增長幅度小（P＜0.05）。

3.3 各組大鼠血清生殖激素 與正常對照組比較，模型組 LH、LH/FSH、T 明顯增高（P＜0.01），F(xiàn)SH、E2明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，用藥后各實驗組LH、LH/FSH、T 明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01），E2增高（P＜0.05 或 P＜0.01）。達英加中藥組 LH、LH/FSH、T、E2與中藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

3.4 各組大鼠血清lep水平比較 模型組大鼠血清lep水平明顯高于正常對照組（P＜0.01）；用藥后，中藥組、達英-35組、達英加中藥組、桂枝茯苓丸組血清lep 水平較模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；中藥組、達英加中藥組間，達英-35、桂枝茯苓丸組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3.5 卵巢組織OB-R、IGF-IR表達 正常對照組大鼠卵巢顆粒細胞及卵泡膜細胞可見OB-R、IGF-IR表達；模型組OB-R、IGF-IR陽性表達較多，明顯高于正常對照組（P＜0.01）；用藥后，中藥組、達英-35+中藥組OB-R、IGF-IR表達較少，明顯低于模型組（P＜0.01）；達英-35組、桂枝茯苓丸組亦低于模型組（P＜0.05），但中藥組、達英+中藥組低于達英-35組和桂枝茯苓丸組（P＜0.05），見表2。

表1 各組大鼠生殖激素比較（±s）

表1 各組大鼠生殖激素比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△p＜0.01；與中藥組比較，▲P＜0.05

組 別 n/只正常組 10模型組 10 LH/(mIU/mL)24.26±3.67 51.96±4.12**中藥組 10 25.11±2.33△△達英-35組 10 42.94±3.57△達英+中藥組 10 23.50±2.77△△▲桂枝茯苓丸組 10 39.95±5.89△FSH/(mIU/mL)9.95±4.12 8.98±7.32*10.40±4.33 12.19±6.25 10.98±9.81 17.92±9.72 LH/FSH T/(ng/mL) E2/(pg/mL)1.98±3.26 0.08±0.31 23.25±2.33 6.15±2.27** 1.83±0.38** 10.10±4.27*2.36±1.73△△ 0.14±0.24△△ 20.01±2.09△△3.01±1.78△ 0.15±0.17△ 14.69±3.08△2.28±2.46△△▲ 0.11±0.24△△▲ 20.10±3.98△△▲2.99±3.43△ 0.39±0.68△ 19.96±2.79△

表2 各組大鼠血清lep、OB-R、IGF-IR水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清lep、OB-R、IGF-IR水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與達英 -35 組比較，▲P＜0.05；與中藥組比較，☆P＜0.05

組 別 n/只正常組 10模型組 10 leptin/(ng/mL)0.83±0.48 4.45±0.48*OB-R 0.80±1.37 10.40±1.37*中藥組 10 2.68±0.67△△達英-35組 10 3.34±0.83△5.60±1.45△△6.30±1.40△達英+中藥 10 2.49±0.69△△桂枝茯苓丸組 10 3.30±0.89△5.40±1.24△△▲7.20±1.96△☆I(lǐng)GF-IR 0.30±0.67 5.60±0.67*2.30±0.65△△3.20±0.75△2.20±0.64△△▲3.10±0.76△☆

4 討論

有研究表明[2]，PCOS存在內(nèi)分泌、代謝障礙以及卵巢組織形態(tài)學(xué)及其功能異常。下丘腦－垂體－卵巢軸的功能紊亂是PCOS最主要的病理生理變化。Lep調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的功能，和OB-R、IGF-IR一起在PCOS的發(fā)生發(fā)展中參與卵泡膜細胞和顆粒細胞的作用，促進卵泡膜細胞合成雄激素，形成PCOS高雄激素血癥。魯海鷗等[3]研究發(fā)現(xiàn)，不同原因不孕癥中血清Lep水平最高的為卵巢功能障礙，推測Lep主要通過影響PCOS患者的卵巢功能影響生殖。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠血清Lep水平升高（P＜0.01），模型組OB-R、IGF-IR陽性表達率明顯增高（P＜0.01）。表明Lep和IGF-IR參與了PCOS的發(fā)生發(fā)展[4-6]。

程涇教授認為，PCOS的致病機制主要是由于脾腎陽虛，痰濕瘀滯沖任所致。治療以健脾益腎，化痰祛瘀調(diào)沖為基本原則，擬方益腎導(dǎo)痰調(diào)沖湯。方中仙靈脾、菟絲子、杞子補腎之力較強，菟絲子[7]水提取物能提高垂體對下丘腦促性腺激素的反應(yīng)性，具有雌激素樣作用，還能促進脂肪分解，對于PCOS肥胖、雄激素過高有一定療效。三藥聯(lián)用取陰中求陽之意。膽南星、白芥子、法半夏、石菖蒲燥濕化痰，水蛭、海藻、山慈菇化瘀散結(jié)，丹參、香附、茺蔚子[8]活血化瘀調(diào)經(jīng)。茺蔚子作為婦科引經(jīng)藥，可引導(dǎo)全方藥物直達病所。各藥合用，使腎充脾旺，痰瘀之邪盡除，陰平陽秘，氣血沖任調(diào)和，則月經(jīng)如期而至，易于攝精成孕。談?wù)滂さ萚9]研究表明，補腎活血中藥可明顯降低PCOS大鼠血清Lep和T水平，并具有明顯的減肥效應(yīng)；提示補腎活血中藥可阻礙PCOS患者肥胖的發(fā)展。本實驗的研究結(jié)果與以上觀點一致。

本實驗結(jié)果顯示，益腎導(dǎo)痰調(diào)沖湯可改善PCOS大鼠的全身狀況及卵巢的局部功能，降低PCOS大鼠血清LH/FSH比值，降低血清T及Lep水平，增高E2水平，下調(diào)OB-R、IGF-IR表達，有助于卵泡的生長發(fā)育及優(yōu)勢卵泡的形成，改善PCOS大鼠的高雄激素血癥及排卵障礙。

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