周玲玲 林瓊瓊 周伶俐 祁旦巳 趙志光 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科 溫州 325000

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholicfattyliver disease，NAFLD）包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）和脂肪性肝硬化，在肥胖者中的患病率為50%，NALFD是導(dǎo)致臨床“隱源性肝酶升高”的最常見(jiàn)原因之一，并且和臨床至少20%原因不明的肝硬化病例密切相關(guān)[1]。脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗（insulin resistance,IR）、線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激/脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)增生、內(nèi)毒素?fù)p傷以及肝臟金屬離子沉積是引起NAFLD發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[2]。近年研究證實(shí)，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗凝血、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗腫瘤等作用[3]。本研究建立NAFLD家兔模型,觀察姜黃素對(duì)NAFLD家兔血脂、胰島素抵抗指數(shù)及肝組織PPAR-γ水平的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 日本大耳白家兔50只，雄性，2～3月齡，體質(zhì)量1.8～2.2kg，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,并在該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。動(dòng)物合格證號(hào)：浙醫(yī)動(dòng)字2200300002。

1.2 藥 物 姜黃素（純度100%）由神威藥業(yè)有限公司提供，用1%羧甲基纖維素鈉配成100mg總姜黃素/mL的液體備用。

1.3 試 劑 即用型PPAR-γ多抗及SABC試劑盒（批號(hào)KIT7710）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 NAFLD模型復(fù)制 50只日本大耳白家兔,給予基礎(chǔ)顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)選取10只家兔作為正常對(duì)照組繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余40只給予高脂飼料（高脂飼料組成:84%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5%紅糖、1%膽固醇，由第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所提供），單籠喂養(yǎng),每天每兔進(jìn)食量為150g，飲水不限。造模過(guò)程中兔子死亡2只，2個(gè)月后隨機(jī)抽取4只家兔處死，NAFLD模型組與正常對(duì)照組比較，TG、TC和LDL-C都顯著升高，說(shuō)明已經(jīng)出現(xiàn)脂肪代謝紊亂；取肝組織病理檢查，4只家兔均表現(xiàn)出中重度的脂肪變性，說(shuō)明NAFLD模型成功建立。余34只NAFLD模型家兔隨機(jī)分成NAFLD組和姜黃素組，各17只。

2.2 給 藥 NAFLD組和姜黃素組家兔繼續(xù)給予基礎(chǔ)顆粒飼料喂養(yǎng)，每天150g。姜黃素組每天按200mg/kg[4-6]體質(zhì)量給予姜黃素混懸液灌胃；NAFLD組和正常對(duì)照組每天給予同容積的生理鹽水灌胃；每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量，持續(xù)治療1個(gè)月。實(shí)驗(yàn)周期共3個(gè)月。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，采血分離血清，部分肝組織于液氮中速凍后保存于-80℃冰箱,以備常規(guī)病理檢查及免疫組化測(cè)定。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.3.1 血脂、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）測(cè)定 第2個(gè)月末 (即姜黃素治療前)禁食12h后,取家兔耳緣靜脈采血2mL；第3個(gè)月末（即姜黃素治療1個(gè)月后）禁食12h，采心臟血2mL。全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定血清 TG、TC、HDL-C、LDL-C、HOMA-IR。

2.3.2 肝組織PPAR-γ表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)SABC法，操作步驟參照說(shuō)明書，用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液液取代一抗作為陰性對(duì)照。PPAR-γ陽(yáng)性表達(dá)主要以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色者為準(zhǔn)，分析采用IPP軟件計(jì)算平均吸光密度值[Density(mean)]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況 在姜黃素藥物治療期間,因灌胃導(dǎo)致姜黃素組1只家兔死亡，NAFLD組1只家兔因肢體偏癱最終死亡。實(shí)驗(yàn)開始前、第2個(gè)月末和第3個(gè)月末,兩組家兔體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 血脂比較 治療前兩組家兔血漿TG、TC、LDLC、HDL-C 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療后姜黃素組各項(xiàng)血脂指標(biāo)均有不同程度改善，TG、TC、LDL-C 降低（P＜0.01），HDL-C 升高（P＜0.05）；NAFLD改喂基礎(chǔ)顆粒飼料后血脂指標(biāo)亦有不同程度改善，TG 降低（P＜0.05），TC、LDL-C 降低（P＜0.01）。與NAFLD組比較，姜黃素組治療后TC、LDL-C、TG明顯降低（P＜0.05），HDL-C 升高（P＜0.05），見(jiàn)表1。

3.3 HOMA-IR、肝組織PPAR-γ蛋白表達(dá)比較 治療前兩組HOMA-IR、PPAR-γ蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療后,姜黃素組 HOMA-IR 顯著降低，PPAR-γ蛋白表達(dá)顯著增高，與NAFLD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 血脂水平比較（±s） mmol/L

表1 血脂水平比較（±s） mmol/L

注：與正常對(duì)照組比較，▲P＜0.01；與治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 NAFLD組比較，△P＜0.05

組 別姜黃素組n/只16 治療前治療后NAFLD組 16 治療前治療后正常對(duì)照組 10 TG 3.23±2.17▲0.72±0.15**△2.95±1.21▲1.08±0.19*0.51±0.12 TC LDL-C HDL-C 37.85±13.32▲ 17.08±5.58▲ 2.33±0.70▲3.47±0.66**△ 2.02±0.43**△ 3.58±0.15*△31.11±13.75▲ 15.49±8.36▲ 2.61±0.77▲4.50±0.79** 2.98±0.74** 2.70±0.15 2.14±0.54 1.43±0.34 5.56±0.87

表2 各組胰島素抵抗指數(shù)和PPAR-γ蛋白比較（±s）

表2 各組胰島素抵抗指數(shù)和PPAR-γ蛋白比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，▲P＜0.01；與治療前比較，*P＜0.05；與 NAFLD組比較，△P＜0.05

組 別 n/只姜黃素組 16治療前治療后PPAR-γ 0.26±0.05▲0.92±0.12*△NAFLD組 16 治療前 15.68±3.4▲ 0.29±0.06▲治療后 13.24±2.7* 0.49±0.09*正常對(duì)照組 10 5.07±1.59 1.14±0.08 HOMA-IR 15.25±3.2▲9.57±1.9*△

3.4 肝臟病理學(xué) 造模2個(gè)月后，正常對(duì)照組家兔肝色鮮紅，邊緣銳利，質(zhì)軟，HE染色顯示肝組織無(wú)明顯脂肪沉積，肝小葉結(jié)構(gòu)正常。造模2個(gè)月后姜黃素組、NAFLD組以及治療后NAFLD組家兔均呈中-重度脂肪肝，肉眼見(jiàn)肝臟體積增大、色黃、邊緣變鈍、質(zhì)脆、切面帶油膩感。為全小葉內(nèi)肝細(xì)胞脂肪變，肝細(xì)胞索排列紊亂。與NAFLD組比較,治療后姜黃素組家兔脂肪變明顯減輕，僅見(jiàn)輕度脂肪變性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組家兔肝臟脂肪變結(jié)果比較（±s）

表3 各組家兔肝臟脂肪變結(jié)果比較（±s）

注：與治療前比較，*P＜0.05；與 NAFLD組比較，△P＜0.05

組 別 n/只++ +++++++0 0 0 0 7 9 3.56±0.57 10 2 0 1.88±0.21*△0 10 6 3.38±0.66 3 9 4 3.06±0.45*肝臟脂肪變程度-10+ 0 0 0脂肪變程度評(píng)分正常對(duì)照組 10姜黃素組 16治療前 0治療后 0 0 4 NAFLD組 16治療前 0治療后 0

4 討論

NALFD的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，有關(guān)發(fā)病學(xué)說(shuō)較多，其中最為成熟的是“二次打擊”學(xué)說(shuō)[7]，第一次打擊為各種原因如肥胖、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致的胰島素抵抗、游離脂酸增加、肝臟脂肪代謝障礙，從而使肝細(xì)胞合成甘油三酯增加而輸出減少，肝細(xì)胞脂肪變性。第二次打擊是在第一次打擊的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化，線粒體功能失調(diào)，呼吸鏈復(fù)合物活性降低，活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成增加，呼吸鏈中傳遞電子的能力降低，ATP生成受阻。同時(shí)，大量的ROS使呼吸鏈中的抗氧化劑被耗竭，體內(nèi)氧自由基增多，形成惡性循環(huán)，形成進(jìn)展性肝纖維化甚至肝硬化。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員，存在3種亞型：PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ。PPAR-γ 參與調(diào)節(jié)機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，在脂細(xì)胞的分化中PPAR-γ具有不可缺少的作用[8]，其作為催化脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶可調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)，增加脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶的表達(dá)，刺激細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝入和向脂酰CoA轉(zhuǎn)化[9]，同時(shí)，PPAR-γ參與肝內(nèi)甘油三酯的平衡代謝，并抑制體內(nèi)其他臟器甘油三酯的沉積，被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞系統(tǒng)調(diào)節(jié)的總開關(guān)。IR是NAFLD發(fā)生及發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。He等[10]研究報(bào)道，脂肪組織 PPAR-γ基因敲除可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞減少和肥大、血 FFA和 TG升高、肝臟IR和脂肪肝的發(fā)生增加。有學(xué)者應(yīng)用PPAR-γ激動(dòng)劑治療NASH患者后觀察到肝組織病理中大泡性脂變及Mallory小體的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞內(nèi)含晶線粒體數(shù)量則明顯增加，PPAR-γ可能改善肝細(xì)胞線粒體的功能[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),NAFLD模型家兔經(jīng)過(guò)姜黃素治療后,肝臟脂肪變性逆轉(zhuǎn),血漿TC、TG、LDL-C顯著降低；血漿HDL-C升高,與國(guó)內(nèi)外研究相似[12-13]。姜黃素治療后,NAFLD模型家兔HOMA-IR明顯減低，PPAR-γ蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明姜黃素對(duì)NAFLD有治療作用。姜黃素可能通過(guò)改善IR，糾正脂代謝紊亂等，逆轉(zhuǎn)NAFLD模型家兔的肝脂肪變性和肝功能異常。姜黃素可能通過(guò)上調(diào)PPAR-γ的表達(dá)，催化脂肪酸氧化減少游離脂肪酸（free fatty ascid，F(xiàn)FA）含量，從而減少超氧陰離子和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，抑制 β-氧化，糾正體內(nèi)氧化和抗氧化失衡狀態(tài),改善線粒體功能，促進(jìn)ATP合成，減輕二次打擊，減輕脂肪變性程度。

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