范廣民 葉 斌 浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院 臺(tái)州 317000

李紹波 浙江省臺(tái)州醫(yī)院

童夏生 阮正英 浙江省臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

亢曉冬 杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院

葉 輝 浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院

哮喘是一種氣道炎癥性疾病，涉及多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分，導(dǎo)致慢性的病理生理改變，表現(xiàn)為氣道組織腫脹、黏液腺增生和黏液栓形成[1]。其機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明。中藥熱毒寧注射液（成分：金銀花、青蒿、梔子）具有抗炎癥、抗病毒、清熱解毒之功效，不僅能有效治療上呼吸道感染、慢性支氣管炎[2-3]，還能在急性肺損傷中起保護(hù)作用[4-5]，在臨床上得到廣泛應(yīng)用。但該藥對(duì)哮喘的治療作用則鮮見報(bào)道。目前已知，腫瘤壞死因子超家族參與了哮喘氣道炎癥過程[6]，但其超家族成員腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF）在哮喘的作用如何，目前知之甚少。本研究通過觀察熱毒寧注射液對(duì)哮喘大鼠肺組織病理改變和TRAF2表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 雞卵白蛋白（OVA）Ⅴ級(jí)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；小鼠抗大鼠TRAF2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；即用型SP系列檢測(cè)試劑盒（其中試劑B：生物素標(biāo)記二抗工作液選用SP-9000）及DAB顯色劑（ZLI-9018）均購(gòu)自北京中山生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠27只，4～5 周齡，體重（121±7）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。隨機(jī)分成哮喘組、對(duì)照組、熱毒寧組，每組9只。

1.3 動(dòng)物模型復(fù)制[7]哮喘組第1天和第8天腹腔注射OVA/Al（OH）3混合液（含OVA1mg和Al（OH）3100mg）2mL致敏，各1次。第15天開始每天向大鼠噴霧（空氣壓縮霧化器：PARI BOY-037G6000 GERMANY）1%OVA 30min，連續(xù)激發(fā) 7 天。造模成功后表現(xiàn)為煩躁不安、搔癢、喘鳴、腹肌抽搐等癥狀。對(duì)照組致敏和激發(fā)均以生理鹽水替代OVA和Al（OH）3，熱毒寧組致敏和激發(fā)方法同哮喘組，不同的是在抗原首次激發(fā)前24 h和每次激發(fā)前0.5 h給予腹腔注射熱毒寧注射液（江蘇康緣藥業(yè)股分有限公司生產(chǎn)，批號(hào) 100618），1 mL/只。

1.4 肺組織標(biāo)本制備 末次激發(fā)24 h后，10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉，心臟抽血致死。取右肺門部位組織塊，4%多聚甲醛-PBS溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色后觀察肺組織病理變化（OLYMPUS-CX40 JAPAN）。

1.5 免疫組化方法 采用SP法測(cè)定TRAF2的表達(dá)[8]。染色步驟如下：①石蠟切片，64℃烤片2h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脫蠟，梯度酒精（依次100%酒精Ⅰ、Ⅱ、95%酒精Ⅰ、Ⅱ、85%酒精、75%酒精）水化，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min；②抗原修復(fù)：使用pH=6.0檸檬酸抗原修復(fù)液高壓鍋抗原熱修復(fù)（高壓鍋旋轉(zhuǎn)閥開始旋轉(zhuǎn)起計(jì)時(shí) 2min）；③3%H2O2室溫孵育 5～10min，PBS 沖洗，2min×3次；④5%～10%正常血清封閉，室溫孵育10min。傾去血清，滴加TRAF2，抗體稀釋濃度為1：20，4℃過夜；PBS沖洗，2min×3次；⑤滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育 10～20min； PBS沖洗，2min×3次；⑥滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育 10～20min；PBS沖洗，2min×3次；⑦DAB 顯色劑顯色；⑧自來水充分沖洗，復(fù)染、脫水透明、封片。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定：光鏡下觀察細(xì)胞著色情況，蛋白定位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色表達(dá)，結(jié)構(gòu)清晰，著色明顯高于背景。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)細(xì)支氣管，Image-pro Plus 5.1免疫組化圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行灰度掃描，取其平均值代表該片的光密度值（OD值）。

2 結(jié)果

2.1 熱毒寧對(duì)肺組織病理學(xué)的影響 HE染色顯示，對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管腔規(guī)則，黏膜上皮完整，較少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。哮喘組肺內(nèi)支氣管及血管周圍見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、黏液腺增生、氣道上皮斷裂和脫落、黏液栓形成等表現(xiàn)。熱毒寧組炎性細(xì)胞數(shù)目較哮喘組明顯減少，黏膜上皮增生不明顯，支氣管腔見較少的炎性分泌物，黏液腺增生不明顯，未見黏液栓的形成，見圖1（封三）。

2.2 熱毒寧對(duì)肺組織TRAF2表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示，陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿呈棕黃色表達(dá)，主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，而肺組織中卻較少表達(dá)。哮喘組支氣管壁TRAF2的光密度值顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；熱毒寧組支氣管壁TRAF2的光密度值與哮喘組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但仍顯著性高于對(duì)照組（P＜0.01），見表1、圖 2（封三）。

表1 三組大鼠支氣管壁TRAF2表達(dá)水平比較（±s）

表1 三組大鼠支氣管壁TRAF2表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.01

組 別 n/只 TRAF2（OD值）對(duì)照組 9 0.220±0.057哮喘組 9 0.317±0.041△熱毒寧組 9 0.291±0.019△

3 討論

中藥是我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥，有著豐富的臨床治療經(jīng)驗(yàn)。常作為一種輔助性藥物用于哮喘和咳嗽變異性哮喘的治療[9-10]，不僅能調(diào)節(jié)哮喘時(shí)的Th1/Th2失衡[11]，還能下調(diào) TNF-α、IgE 等炎癥因子[12]。熱毒寧注射液主要成分為青蒿、金銀花、梔子，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的作用。青蒿辛、苦、寒，辛以解表、寒以清熱是解表清熱、宣郁散邪之良藥。研究表明，青蒿具有免疫抑制和細(xì)胞免疫促進(jìn)作用。金銀花具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、解熱抗炎、利膽、保肝、降脂等多種藥理作用。梔子性寒、味苦、無毒，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血散瘀的功效。本研究發(fā)現(xiàn)，熱毒寧組肺組織支氣管黏膜上皮增生、支氣管腔炎性分泌物、黏液腺增生和黏液栓的病理改變較哮喘組顯著性減輕，尤其是炎性細(xì)胞數(shù)目較哮喘組明顯減少，提示熱毒寧注射液具有抗炎作用，能夠抑制哮喘的氣道炎癥，為哮喘治療提供了新的前景。

TRAFs是TNF受體超家族和IL-1R/TLR超家族信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要成分，TNF信號(hào)傳導(dǎo)中，TRAF2作為接頭蛋白和調(diào)控因子在幾乎所有分支通路中起作用，在調(diào)節(jié)TNF-R1介導(dǎo)的NF-κB和JNK激活過程中起重要作用。TRAF在天然免疫和獲得性免疫中都起重要作用，是細(xì)胞凋亡和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[13]。TRAF不僅能增強(qiáng)TNFR誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生，而且能增強(qiáng)TNFR1-TNFR2的協(xié)同作用[14]，還與炎癥細(xì)胞的分化有關(guān)[15]。TRAF2是TRAF家族的經(jīng)典成員，幾乎在所有組織中轉(zhuǎn)錄，是表達(dá)最為廣泛的TRAF家族成員。TRAF2能與TNF受體家族中的大多數(shù)成員相互作用，并在TNF-R1介導(dǎo)的NF-κB和JNK的激活過程中起作用，對(duì)多種生理過程十分重要，如細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡、發(fā)育、癌基因的表達(dá)、免疫和感染等[16]。

本研究結(jié)果顯示，陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿呈棕黃色表達(dá)，提示TRAF2表達(dá)部位在細(xì)胞漿。它主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中，而肺組織和支氣管平滑肌中卻較少表達(dá)，提示它可能主要是通過氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞起作用。而TRAF1主要表達(dá)在支氣管平滑肌細(xì)胞，可能是通過支氣管平滑肌細(xì)胞的途經(jīng)參與哮喘氣道高反應(yīng)性[17]。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，哮喘組支氣管壁TRAF2的光密度值顯著高于對(duì)照組，提示TRAF2可能與哮喘的氣道炎癥有關(guān)。相似的研究[18]也發(fā)現(xiàn)，在OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞（嗜酸細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）、Th2細(xì)胞因子和氣道高反應(yīng)性顯著增加，而TRAF1缺失的小鼠則沒有上述改變，認(rèn)為TRAF1可能是促進(jìn)哮喘炎癥的一個(gè)細(xì)胞因子。上述表明，TRAF家族在哮喘的發(fā)病中可能起了致炎的作用，抑制或阻斷TRAF的信號(hào)通路可能是治療哮喘另一個(gè)有效的途經(jīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，熱毒寧組支氣管壁TRAF2的光密度值與哮喘組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仍顯著性高于對(duì)照組。提示熱毒寧抑制哮喘氣道炎癥可能不是通過TRAF2途徑，或其量效關(guān)系還沒有發(fā)現(xiàn)。

上述結(jié)果表明，哮喘大鼠TRAF2的表達(dá)水平增強(qiáng)，它可能參與了哮喘的氣道炎癥過程。熱毒寧能減輕哮喘大鼠氣道炎癥，可能不是通過TRAF2途徑，其機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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