王文豪，張丹琳，蘇丹萍，賀東生

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣東省人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

豬大腸桿菌是條件性致病菌，可終年使豬群發(fā)病，且各年齡段的豬均可發(fā)病，尤其對仔豬的危害異常嚴(yán)重。多年來，對于大腸桿菌病的防控主要是通過接種滅活苗的方法進(jìn)行的。這種方法固然起到一定的效果，但由于大腸桿菌血清型眾多，不同菌株的交叉免疫保護(hù)力低下。因此，滅活苗不能在很大的范圍內(nèi)推廣應(yīng)用。而大腸桿菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，且對不同菌株有交叉保護(hù)能力，是一種良好的保護(hù)性抗原[1-2]。外膜蛋白疫苗將會有較好的發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)從廣東省豬大腸桿菌優(yōu)勢血清型O107中，選出一株有致病性的菌株，并對該菌株的外膜蛋白進(jìn)行抽提，以期為外膜蛋白亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

腸致病性大腸桿菌O107由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室分離鑒定得到。

1.2 主要化學(xué)試劑

2%的十二烷基肌氨酸,純度≥95%,分析純,過硫酸銨,sigma 公司產(chǎn)品。10 mmol/L的HEPES(N-2-羥乙基哌嗪- N′-2-乙磺酸),pH7.4,純度≥99%，分析純,丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺,Amresco 公司產(chǎn)品。Tris、溴芬蘭、甘油、β-巰基乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)試劑，低分子質(zhì)量蛋白Marker購買于Bio-Rad公司。

1.3 主要儀器

超速離心機(jī)，型號為BECKMANL8-M ,貝克曼產(chǎn)品。高速冷凍離心機(jī)( 6K15)，購于Sigma公司。超聲波細(xì)胞粉碎儀(FS300)，購于上海生析超聲儀器有限公司。氣浴恒溫振蕩器(搖床)，SHZ-82型，江蘇金壇中大儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 OMP 的提取

將菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)18～24 h；挑取單個(gè)菌落接種于6 mL營養(yǎng)肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h；培養(yǎng)物以4 ℃、6 000 g離心10 min；將沉淀懸浮于5 mL HEPES(10 mmoL/L，pH 7.4 )中，78 W超聲裂解10 min;裂解物4 ℃、6 000 g離心10 min，棄去上清液；加入約5倍體積的2%N-十二烷基肌氨酸鈉室溫作用30 min，分裝于30 mL超速離心管中，10 ℃、110 000 g離心1 h；將沉淀懸浮于0.5 mL HEPES(10 mmoL/L，pH值7.4)中,置-20 ℃保存，備用。

1.4.2 電泳檢測

1.4.2.1 SDS - PAGE 將上述外膜蛋白樣品15μL與等量樣品緩沖液混合，100 ℃水浴加熱5 min，加樣品于垂直電泳槽的樣品孔中，恒壓90 V電泳。樣品緩沖液為含4%SDS，20 %甘油,5%β-巰基乙醇，0.002 %溴酚藍(lán)的0.1 mol/L Tris HCl(pH6.8)。

1.4.2.2 考染 凝膠剝離后，用染色液(0.25%考馬斯亮蘭- R250、10%冰醋酸、50%甲醇)染色大約4 h后,用脫色液(5%甲醇、7%冰醋酸)振蕩脫色至條帶清晰背景干凈透明為止,拍照。

2 結(jié)果

大腸桿菌O107OMP的SDS - PAGE考染結(jié)果(見圖1)。

由圖1可見，菌株OMP條帶大致集中于31～37 ku之間， 菌株呈現(xiàn)2 條帶,這與報(bào)道的畜禽大腸桿菌主要OMP分子質(zhì)量相符，說明該實(shí)驗(yàn)成功地提取了大腸桿菌外膜蛋白。

3 討論與分析

1）本實(shí)驗(yàn)主要參考了高崧等報(bào)道的禽源性大腸桿菌OMPs 提取方法,對豬致病性大腸桿菌O107的OMPs 進(jìn)行初步提取試驗(yàn)。外膜蛋白是重要的毒力因子，試驗(yàn)證明，抽提的外膜蛋白與基因工程表達(dá)出來的外膜蛋白都具有良好的免疫原性。本試驗(yàn)針對廣東地區(qū)豬大腸桿菌優(yōu)勢血清型O107的OMP做了初步提取,以期為OMP亞單位疫苗的研制的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)性材料。

圖1 E1coli OMP考染電泳圖

2）近年來的試驗(yàn)研究表明，通過血清型鑒定試驗(yàn)雖然可以給大腸桿菌分型，但此種方法不能反映不同大腸桿菌分離株之間的遺傳相關(guān)性,而外膜蛋白可反映病原性大腸桿菌分離株的遺傳標(biāo)志。同一血清型的菌株可能屬于不同的外膜蛋白型，而不同血清型的菌株也可能屬于同一外膜蛋白型[3]。本實(shí)驗(yàn)中豬大腸桿菌優(yōu)勢血清型O107的OMP有2個(gè)條帶，外膜蛋白型為2型，是否廣東地區(qū)流行的血清型O107其他菌株也具有2條帶或不同的條帶數(shù)尚需進(jìn)一步研究。

[1] 高崧，劉秀梵，張如寬.一種快速提取禽源性大腸埃希氏菌外膜蛋白的方法[J].微生物學(xué)通報(bào),1996,23(2):122-124.

[2] 高崧，等.我國部分地區(qū)禽源性大腸桿菌的外膜蛋白型[J].微生物學(xué)報(bào),1999,39(3):226-233.

[3] 丁伯良，鄢明華，王英珍，等.天津地區(qū)雞致病性大腸桿菌血清型分布及其優(yōu)勢血清型的外膜蛋白型研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003,24（2）：94-96.