陳 鵬，王志萍，李 文，胡明道

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650101）

原發(fā)性肝癌是我國男、女性因惡性腫瘤致死的第二和三位原因，五年生存率僅5%左右。究其原因，一是很多肝癌病人在診斷后腫瘤已不能切除；此外肝癌切除術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高達(dá)60～80%。但目前尚缺少一種有效的方法預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，肝細(xì)胞癌對大多數(shù)抗癌藥物敏感性差，傳統(tǒng)的化療藥物毒副作用大，療效不理想。因此尋找一種低毒副作用藥物能抑制肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移顯得很有意義。三七總皂苷是中藥三七的主要藥物成分，具有低毒副作用的特點(diǎn)，本文應(yīng)用不同濃度三七總皂苷作用于高轉(zhuǎn)移性的人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系HCCLM3，觀察對肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 高轉(zhuǎn)移性的人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系HCCLM3購買于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所。

1.1.2 藥物及試劑 三七總皂苷（從五加科人參屬多年生草本植物三七中提取的有效成分）購自昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，二苯基四氮唑溴鹽（MTT）為美國sigma公司產(chǎn)品，二甲基亞砜（DMSO）為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) HCCLM3細(xì)胞用含15%新生胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、混合氣體的孵箱（95%飽和濕度）內(nèi)培養(yǎng)。每2天換液1次。細(xì)胞單層貼壁生長，待長滿瓶底時，用胰蛋白酶消化液消化成單個細(xì)胞，繼續(xù)傳代。

1.2.2 MTT法測定細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以4×103個／孔濃度接種于96孔板，每孔含100μl細(xì)胞懸液。每組設(shè)3個平行孔，并設(shè)空白對照。貼壁培養(yǎng)24h后，換含有終濃度為25、50、100、200、400mg／L三七總皂苷培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，對照組培養(yǎng)液僅含0.04%DMSO。分別培養(yǎng)24h、48h及72h后取出培養(yǎng)板，并加入20ul／孔的MTT繼續(xù)培養(yǎng)。3h后，吸盡每孔中的液體，加入二甲基亞砜150μl／孔，在震蕩器上震蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解。在全自動酶標(biāo)讀數(shù)儀上分別測定570nm波長處不同時間（24h、48h、72h）、不同藥物濃度下的吸光度值（A570），并計算細(xì)胞的存活率。存活率＝藥物組A570／對照組A570×100%。

1.2.3 一般形態(tài)觀察 將對數(shù)生長期的HCCLM3細(xì)胞消化，計數(shù)、調(diào)整濃度為3×105／mL，接種于6孔板中，1.0mL／孔，再加入高糖DMEM完全培養(yǎng)基1.5mL。待24h細(xì)胞貼壁開始生長后，換液并加入含0.04%DMSO（對照組）及200mg／L的三七總皂苷培養(yǎng)液，處理48h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞形態(tài)的變化并照相。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測不同濃度三七總皂苷不同時間對 HCCLM3細(xì)胞增殖的影響 由以下表1可見不同濃度（25～400mg／L）的三七總皂苷處理HCCLM3細(xì)胞24～72h后，出現(xiàn)對細(xì)胞增殖不同程度的抑制作用。其中處理48h后三七總皂苷作用開始明顯，且具有明顯濃度依賴性，隨濃度增加抑制作用更明顯。從24～48h，三七總皂苷的作用具有時間依賴性，隨時間延長，作用更明顯，結(jié)果見表1。

表1 三七總皂苷對HCCLM3細(xì)胞存活率的影響（±s，%）

表1 三七總皂苷對HCCLM3細(xì)胞存活率的影響（±s，%）

同一時間治療組均數(shù)與對照組相比，＊P＜0.05；同一時間與上一組濃度相比，△P＜0.05；同一濃度與上一組時間相比，▲P＜0.05

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2.2 倒置顯微鏡下觀察三七總皂苷對HCCLM3細(xì)胞生長和形態(tài)的影響 置顯微鏡下HCCLM3細(xì)胞為多邊形上皮樣細(xì)胞，成單層生長，細(xì)胞間相互連接，胞漿豐富，胞核大而圓。經(jīng)200mg／L的三七總皂苷處理48h后細(xì)胞密度降低，細(xì)胞相互分離，部分細(xì)胞脫落呈懸浮狀，并見細(xì)胞碎片。（見圖1）

3 討論

腫瘤所體現(xiàn)的各種惡性生物學(xué)行為是由單個腫瘤細(xì)胞來行使的，欲在這個層次上開展工作需要有一個適宜的研究對象－肝癌細(xì)胞系。本實驗采用復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建立的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HCCLM3。該細(xì)胞能夠合成并分泌甲胎蛋白、白蛋白并細(xì)胞角質(zhì)蛋白8陽性，具備肝癌細(xì)胞特點(diǎn)；用該細(xì)胞瘤組織原位接種于裸鼠肝臟，5周后腹壁轉(zhuǎn)移100%、腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移80%、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移100%、膈肌轉(zhuǎn)移70%、肺轉(zhuǎn)移100%，具有良好的自發(fā)性轉(zhuǎn)移特性［1］。

中藥三七主要功用為化瘀止血，消腫止痛，目前也有三七提取物用于治療腫瘤的研究［2～4］。三七總皂苷是中藥三七的主要藥物成分。筆者的實驗以肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞HCCLM3增殖具有抑制作用，并呈時間和劑量依賴關(guān)系。通過倒置顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)200mg／L的三七總皂苷作用48h后貼壁細(xì)胞密度降低，細(xì)胞脫落死亡。

肝癌術(shù)后較高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率是進(jìn)一步改善肝癌預(yù)后的重大障礙。但目前尚缺少一種有效的方法預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。云南省是三七的主要產(chǎn)地，三七具有低毒副作用的特點(diǎn)，開發(fā)三七的作為預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的輔助藥物具有良好的臨床應(yīng)用前景和重大的社會和經(jīng)濟(jì)價值。筆者的研究發(fā)現(xiàn)三七提取物三七總皂苷對肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞具有抑制作用，作用機(jī)制尚待于進(jìn)一步研究。

［1］李雁，湯釗猷，葉勝龍，等 .體內(nèi)連續(xù)篩選法建立自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2002，82（9）：601～605.

［2］張志信，黃保貴，張仕秀，等 .三七莖葉總黃酮對SMMC－7721細(xì)胞增殖的影響［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2006，27（6）：37～38.

［3］王志斌，李軍祥，朱陵群，等 .三七提取物對 GES－1細(xì)胞及MNNG轉(zhuǎn)化后GES－1細(xì)胞增殖的抑制作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2004，2（6）：445～448.

［4］楊芬，劉浩，余美玲，等 .三七粉對小鼠S180移植腫瘤的抑制作用及免疫能力的影響［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，34（3）：195～197.