張寶友，李春英，趙春建

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040)

山竹 (Garcinia mangostana L.)又稱山竹子、莽吉柿、鳳果和倒捻子素，是藤黃科 (Guttiferae)藤黃屬 (Garcinia)常綠喬山竹的果實(shí)。原產(chǎn)于印度尼西亞和馬來(lái)西亞，是一種典型的熱帶水果，主要分布于泰國(guó)、越南、馬來(lái)西亞、印度尼西亞和菲律賓等東南亞國(guó)家，我國(guó)臺(tái)灣、福建、廣東和云南也有引種［1］。山竹果皮一直作為泰國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥用于腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、慢性潰瘍、白帶、淋病、白血病、乳腺癌、肝癌等疾病治療［2-6］。近年來(lái)，山竹，特別是山竹果皮的化學(xué)成分及其生物學(xué)活性成為人們的研究熱點(diǎn)［7-9］。本文旨在探討山竹提取物的抗氧化活性，為山竹果皮的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山竹 (Garcinia mangostana)購(gòu)自哈爾濱市水果市場(chǎng)，去除果肉，果皮氣干后，用小型粉碎機(jī)粉碎后進(jìn)行提取。

Folin-Ciocalteu試劑、DPPH、兒茶素、氮藍(lán)四唑、黃嘌呤氧化酶購(gòu)自Sigma公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司;R-1001-V/VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;TSHZ-2A臺(tái)式水浴恒溫振蕩器，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;HYQ-2121A渦旋混勻器，南京暢翔儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;PT1200型手持式組織均質(zhì)機(jī)，上海易擴(kuò)儀器有限公司;Stat Fax 2100酶標(biāo)儀，美國(guó)Awareness公司。

1.3 山竹果皮有效成分的提取

山竹果皮粉用70%乙醇冷浸提取3次，每次2天，萃取液過(guò)濾，一部分濾液50℃下減壓濃縮至原體積的1/5，得濃縮液，備用;另一部分濾液50℃下減壓濃縮至干。

1.4 山竹果皮提取物分段萃取

山竹果皮乙醇提取物濃縮液依次以二氯甲烷、正丁醇進(jìn)行液液萃取，將山竹果皮乙醇提取物初步分為二氯甲烷可溶部分、正丁醇可溶部分和水可溶部分3個(gè)分離部分，每一分離部分分別濃縮至干，并稱重。

1.5 總酚含量測(cè)定及統(tǒng)計(jì)分析

總酚含量按照Folin-Ciocalteu法測(cè)定［10］，并適當(dāng)修改:以兒茶素為對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)時(shí)，取500μL Folin-Ciocalteu試劑 (1 N)加入500 μL不同濃度兒茶素于離心管中，渦旋混勻30 s，并靜置5 min后，添加1 mL 20%Na2CO3再靜置10 min。然后離心，取上清液，于730 nm測(cè)定吸光值，并根據(jù)此吸光值與兒茶素濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品分析，以1 mg·mL-1樣品取代兒茶素，其余操作同上。將樣品吸光值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線即可算出每克提取物中所含兒茶素相對(duì)量，并以此表示山竹果皮的總酚含量。本試驗(yàn)為3次重復(fù)。

利用SAS系統(tǒng)中Scheffe統(tǒng)計(jì)方法，檢驗(yàn)山竹果皮各可溶部分的總酚含量是否具顯著差異，分析時(shí)所使用的置信區(qū)間為95%。

1.6 抗氧化活性試驗(yàn)

1.6.1 DPPH 自由基清除效應(yīng)

方法［11］，并做適當(dāng)調(diào)整:取1000μL DPPH乙醇溶液 (0.1 mmol·L-1)、450μL Tris-HCl緩沖液 (50 mmol·L-1，pH 7.4)與50 μL 不同濃度的試驗(yàn)樣品或者維生素C溶液，渦旋混勻后避光靜置30 min，于517 nm下測(cè)定吸光值。以同體積乙醇代替樣品同法操作，為對(duì)照。本試驗(yàn)為3次重復(fù)。根據(jù)吸光值計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中:Aa為試驗(yàn)組吸光值;AC為對(duì)照組吸光值。

1.6.2 超氧自由基作用試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)方法［12］，并略有改動(dòng):取 20μL 15mmol· L-1Na2EDTA(用 50 mmol· L-1KH2PO4/KOH 緩沖液配制)、50 μL 0.6 mmol·L-1氮藍(lán)四唑 (以50 mmol·L-1KH2PO4/KOH緩沖液配制)、30 μL 3 mmol·L-1肌苷 (以50 mmol·L-1KOH配制)、5μL不同濃度的試驗(yàn)樣品以及145μL緩沖液 (50 mmol·L-1KH2PO4/KOH，pH 7.4)于96孔板中均勻混合。再迅速添加50μL黃嘌呤氧化酶 (0.1 U·mL-1)，反應(yīng)過(guò)后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm下吸光值，每20 s測(cè)量一次，并持續(xù)測(cè)量5 min。以同體積的乙醇作為對(duì)照，計(jì)算對(duì)照組與試驗(yàn)組其反應(yīng)速率，并按照下式計(jì)算試驗(yàn)樣品的超氧自由基清除率 (%)。本試驗(yàn)為3次重復(fù)。

式中:Ka為試驗(yàn)組反應(yīng)速率;KC為對(duì)照組反應(yīng)速率。

1.6.3 β-胡蘿卜素漂白法測(cè)定抗氧化能力

取10mL 0.01mg·mL-1β-胡蘿卜素氯仿溶液加入20 mg亞油酸和100 mg吐溫40，置于旋轉(zhuǎn)瓶于50℃蒸出氯仿。加入50 mL含氧蒸餾水，超聲成乳狀液。取200μL不同濃度的樣品或兒茶素乙醇液與5 mL乳狀液混合，以等量乙醇代替樣品與乳狀液混合作為空白樣。50℃保溫2 h，于470nm下測(cè)定吸光度。本試驗(yàn)為3次重復(fù)。用下式計(jì)算抗氧化率。

式中:A1為t=2 h時(shí)樣品的吸度度;AC1為t=2 h時(shí)空白樣的吸光度值，AC0為t=0時(shí)空白樣的吸光度值。

1.6.4 還原力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法［13］:先將500μL不同濃度的試驗(yàn)樣品、500μL 0.2M 磷酸緩沖液 (pH 6.6)與500μL1% 鐵氰化鉀混合，50℃保溫20 min，然后加入500μL 10%三氯乙酸，離心 (3000 rpm，10 min)，取500μL上清液，再添加500μL去離子水及100μL 0.1%FeCl3，混勻，靜置10 min后測(cè)定700 nm下的吸光值。吸光值越高代表其還原能力越強(qiáng)。本試驗(yàn)為3次重復(fù)。

1.6.5 抗脂質(zhì)過(guò)氧化試驗(yàn)

從雞蛋中分離出蛋黃，并用組織勻漿機(jī)攪拌呈漿狀，此勻漿物作為脂質(zhì)試驗(yàn)材料。分析時(shí)，于勻漿物中添加50μL不同濃度的試驗(yàn)樣品，并以100 μL 10 μmol·L-1FeSO4和 100 μL 0.1 mmol·L-1維生素C于37℃反應(yīng)1 h以引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。反應(yīng)后，隨即以500μL 28%的三氯乙酸和750μL 1%的硫代巴比妥酸于沸水中終止反應(yīng)。反應(yīng)物離心去除沉淀，上清液于532 nm下測(cè)定吸光值，并按下式計(jì)算各提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率。本試驗(yàn)為3次重復(fù)。

式中:Ka為試驗(yàn)組反應(yīng)速率;KC為對(duì)照組反應(yīng)速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 山竹果皮各可溶部分總酚含量

山竹果皮乙醇提取物濃縮液經(jīng)由液液分配萃取初步分為二氯甲烷可溶部分、正丁醇可溶部分、水可溶部分以及水不可溶部分4個(gè)部分。各個(gè)可溶部分干燥粉末在乙醇提取物中的比例及總酚含量測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 山竹果皮乙醇提取物的總酚含量Tab.1 Total phenolic contents of ethanolic extracts from mangosteen pericarp

從表1可以看出，正丁醇可溶部分總酚含量最高，然后依次是乙醇提取物、二氯甲烷可溶部分及水可溶部分，總酚含量差異顯著 (P〈0.05)。

2.2 山竹果皮各可溶部分的抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基清除效應(yīng)

山竹果皮乙醇提取物及各可溶部分供氫的能力可由清除DPPH自由基能力得到。圖1為山竹果皮乙醇提取物及各可溶部分清除DPPH自由基的結(jié)果。

從圖1可以看出乙醇提取物及各個(gè)可溶部分的清除率隨濃度的增加而增大。比較各個(gè)可溶部分的清除率，以正丁醇可溶部分最大，其次為乙醇提取物、二氯甲烷可溶部分，而以水可溶部分的清除效果最差。經(jīng)計(jì)算，正丁醇可溶部分的IC50為10.7 μg·mL-1，乙醇提取物、二氯甲烷可溶部分及水可溶部分 IC50分別為 21.8、28.9 及 48.1 μg·mL-1。根據(jù)楊冬梅［14］的研究結(jié)果，DPPH自由基的清除能力與多酚類含量成正比，而本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，山竹果皮的酚類化合物含量愈多，對(duì)DPPH自由基的清除率越高。

圖1 山竹果皮提取物清除DPPH自由基的能力Fig.1 Free-radical scavenging activity of the extracts from mangosteen pericarp by DPPH assay

2.2.2 超氧自由基作用

山竹果皮乙醇提取物及各可溶部分清除超氧自由基能力的結(jié)果如圖2所示。從圖2可見，隨著提取物濃度的增高，超氧自由基的清除能力也隨之增大。其中，以正丁醇可溶部分對(duì)超氧自由基的清除最為顯著 (IC50為7.2μg·mL-1)，其次分別為乙醇提取物、水可溶部分及二氯甲烷可溶部分 (IC50分別為11.6、23.0、46.2 μg·mL-1)。

圖2 山竹果皮提取物清除超氧自由基的能力Fig.2 Superoxide free radical scavenging activity of the extracts from mangosteen pericarp

2.2.3 β-胡蘿卜素漂白的抑制效果

山竹果皮提取物及各可溶部分對(duì)β-胡蘿卜素漂白的抑制效果如圖3所示。從圖3可以看出，乙醇提取物及其正丁醇可溶部分對(duì)β-胡蘿卜素漂白的抑制率均比兒茶素好。經(jīng)計(jì)算，乙醇提取物及其正丁醇可溶部分對(duì)β-胡蘿卜素漂白的IC50值分別為537μg·mL-1和 469μg·mL-1，而兒茶素的IC50值大于 2000 μg·mL-1。

圖3 山竹果皮提取物對(duì)β-胡蘿卜素漂白的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of the extracts from mangosteen pericarp onβ-carotene bleaching

2.2.4 還原力的測(cè)定

乙醇提取物及各可溶部分還原力的強(qiáng)弱如圖4所示。圖4結(jié)果顯示，乙醇提取物及各可溶部分的還原力隨濃度的增加而增大，濃度在100μg·mL-1時(shí)，正丁醇可溶部分、乙醇提取物、水可溶部分及二氯甲烷可溶部分于在700 nm的吸光值分別為1.6、1.2、0.9及0.8，此結(jié)果表明，正丁醇可溶部分的還原力最佳，其次為乙醇提取物、水可溶部分，而以二氯甲烷可溶部分的還原力最差。

圖4 山竹果皮提取物的還原力Fig.4 Reducing power of the extracts from mangosteen pericarp

2.2.5 抗脂質(zhì)過(guò)氧化試驗(yàn)

山竹果皮乙醇提取物及各可溶部分抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力如圖5所示。由圖5結(jié)果可知乙醇提取物及各可溶部分對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力隨濃度的增加而增大，其中，正丁醇可溶部分的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力最佳，其次為二氯甲烷可溶部分及乙醇提取物，水可溶部分抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力最差。

圖5 山竹果皮提取物的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力Fig.5 Inhibitory lipid peroxidation activity of the extracts from mangosteen pericarp

3 討論

本文利用DPPH自由基清除、超氧自由基清除、β-胡蘿卜素漂白、還原力及抗脂質(zhì)過(guò)氧化等試驗(yàn)方法評(píng)估了山竹果皮提取物的抗氧化活性，試驗(yàn)結(jié)果表明，山竹果皮提取物各部分中均以正丁醇可溶部分抗氧化活性最好。各部分總酚含量依次為正丁醇可溶部分〉二氯甲烷部分〉水可溶可溶部分。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，山竹果皮具有較高的抗氧化能力，因此有必要對(duì)山竹進(jìn)行深入的研究，并評(píng)估其抗氧化應(yīng)用的可行性。

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