趙詠梅，王希柱，劉寶義

(1.開灤集團(tuán)有限責(zé)任公司林西醫(yī)院，河北 唐山 063103；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬唐山人民醫(yī)院，河北 唐山 063000)

研究表明，心理應(yīng)激時(shí)經(jīng)神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制釋放的應(yīng)激激素能夠啟動(dòng)或參與和炎癥反應(yīng)相似的調(diào)節(jié)機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，引起血管壁的慢性炎癥反應(yīng)，即心理性刺激觸發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)實(shí)際上涵蓋了炎癥反應(yīng)[1-2]，但其機(jī)制尚不明確。Toll樣受體(TLRs)是一種介導(dǎo)炎癥和天然免疫的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族，其中TLR4與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展及斑塊穩(wěn)定性關(guān)系密切[3]。本研究擬通過慢性空瓶刺激建立大鼠心理應(yīng)激模型，觀察各組大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)和主動(dòng)脈TLR4表達(dá)并進(jìn)行定量分析，初步探討心理應(yīng)激對(duì)大鼠氧化應(yīng)激的影響及TLR4所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備 兔抗大鼠TLR4多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔SP-9001免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TNF-α放免試劑盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所；高速冷凍離心機(jī)(法國(guó)Jouan公司)、0725型紫外光柵分光光度儀(山東高密分析儀器廠)、光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，HH-4型數(shù)顯恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)、DHG(102)型電熱干燥箱(山東濰坊醫(yī)療器械廠)、RM213轉(zhuǎn)輪石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)條件 健康雄性Wistar大鼠40只，體重180～200 g。由華北煤炭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)環(huán)境下，室溫18℃～21℃、相對(duì)濕度45%～55%。

1.3 動(dòng)物分組與處理 將40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)、無(wú)應(yīng)激組(NS)、生理應(yīng)激組(PS)和心理應(yīng)激組(ES)，每組各10只。ES組和PS組分別在不同的房間單籠喂養(yǎng)，NC組和NS組每籠5只。NS組、PS組和ES組給予高脂飲食+維生素D3負(fù)荷(一次性腹腔注射維生素D360萬(wàn)IU/kg)，NC組給予普通飲食+生理鹽水(一次性腹腔注射等體積生理鹽水)。高脂飲食配方：3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%普通飼料。

1.4 應(yīng)激模型的建立 參照邵楓等[4]的方法制作心理應(yīng)激模型。所有動(dòng)物經(jīng)一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，定時(shí)喂水訓(xùn)練8周：每天僅在8:00～8:10和20:00～20:10給予定時(shí)飲水兩次，每次10 min，其余時(shí)間不予飲水。于第8周最后一次定時(shí)飲水期間開始給予心理應(yīng)激和生理應(yīng)激。具體方法是ES組大鼠在原定時(shí)喂水期間不喂水并給予無(wú)規(guī)律的空瓶刺激，每天0～2次不等，使之產(chǎn)生慢性情緒應(yīng)激。PS組大鼠在此期間亦不喂水，但也不給予空瓶刺激，目的是對(duì)比觀察生理性缺水對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。應(yīng)激在連續(xù)的兩周內(nèi)被給予14次，每次10 min。NS組和NC組大鼠繼續(xù)2次/d定時(shí)飲水。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期為10周。

1.5 標(biāo)本采集與觀察指標(biāo) 于末次應(yīng)激結(jié)束后立即用10%水合氯醛(30 mg/kg)行腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血、靜置、離心(3 000 rpm)、收集血清分裝，置于-20℃冰箱保存待檢。取血后取主動(dòng)脈根部至主動(dòng)脈弓處血管0.5 cm，4℃生理鹽水沖洗、4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，用于HE染色及免疫組化測(cè)定TLR4表達(dá)(SP法)。黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)過氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)丙二醛(MDA)，放射免疫法測(cè)定血清腫瘤壞死因子(TNF-α)水平，操作程序嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。利用光鏡(400倍)觀察TLR4表達(dá)和分布情況，以血管內(nèi)膜出現(xiàn)棕黃色者為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，采用Micro-Optic數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析陽(yáng)性細(xì)胞單位面積平均光密度值(OD)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩組間比較方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激 ES組大鼠血清SOD活力明顯低于其他三組而MDA含量明顯升高；NS組、PS組血清SOD活力低于NC組而MDA含量升高；PS組與NS組比較，血清SOD活力亦降低、MDA含量升高，見表1。

表1 各組大鼠血清SOD、MDA比較（±s）

表1 各組大鼠血清SOD、MDA比較（±s）

注：同NC組比較，●P<0.05；同NS組比較，★P<0.05；同PS組比較，▲P<0.05。

組別MDA(nmol/ml)SOD(U/ml)NC NS PS ES 5.58±0.22 6.31±0.18●6.56±0.22●★7.58±0.34●★▲222.31±13.61 200.71±12.91●187.22±10.28●★170.57±11.28●★▲

2.2 炎性相關(guān)因子 NC組、NS組、PS組和ES組的大鼠血清TNF-α分別為(1.772±0.0751)μg/L、(2.181±0.0847)μg/L、(2.189±0.0989)μg/L和(2.447±0.083)μg/L。ES組大鼠血清TNF-α水平明顯高于其他三組；NS組、PS組亦高于NC組；PS組與NS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 主動(dòng)脈HE染色 光鏡顯示ES組大鼠主動(dòng)脈出現(xiàn)早期AS改變：血管內(nèi)膜連續(xù)性中斷，內(nèi)皮細(xì)胞不規(guī)則脫落，內(nèi)彈力板薄厚不均勻，部分交織狀排列或呈波浪狀，并出現(xiàn)斷裂分離現(xiàn)象，平滑肌細(xì)胞增生且與中層彈力板之間排列紊亂。其余三組未見明顯形態(tài)學(xué)改變。

2.4 主動(dòng)脈TLR4表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示TLR4在NC組幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，NS組、PS組、ES組均有表達(dá)，OD值分別為(0.037±0.005)、(0.238±0.015)、(0.250±0.012)和(0.334±0.010)，蘇木素復(fù)染顯示其主要表達(dá)于血管內(nèi)膜。ES組表達(dá)強(qiáng)度明顯高于PS組和NS組；PS組與NS組表達(dá)強(qiáng)度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)所采用的慢性空瓶刺激是一種與憤怒或焦慮關(guān)系更為密切的慢性心理應(yīng)激模型[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ES組、PS組、NS組均出現(xiàn)了明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)(血清SOD活力下降而MDA含量上升)和炎癥反應(yīng)(血清TNF-α升高)。而ES組較其他兩個(gè)處理組引起的導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)因素變化更為明顯：氧化應(yīng)激損傷(血清SOD活力下降而MDA含量升高)、炎癥反應(yīng)(血清TNF-α升高)。PS組較NS組氧化應(yīng)激損傷更為明顯(血清SOD活力下降而MDA含量上升)，但兩組間炎癥反應(yīng)(血清TNF-α)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。主動(dòng)脈HE染色顯示，ES組出現(xiàn)了早期AS改變，但并無(wú)動(dòng)脈硬化斑塊等典型AS病理變化。

研究表明，氧化應(yīng)激在AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。過多的活性氧不僅直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，還通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)引起炎癥反應(yīng)效應(yīng)物的相關(guān)基因核轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)血管局部炎癥反應(yīng)。MDA反映體內(nèi)活性氧水平，間接地體現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷的嚴(yán)重程度。SOD是一種抗氧化酶，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心理應(yīng)激可導(dǎo)致明顯的氧化應(yīng)激損傷，與既往研究結(jié)果一致[6-7]。NS組、PS組大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)亦較NC組明顯，提示不僅是心理應(yīng)激，生理應(yīng)激和高脂飲食也能影響動(dòng)物體內(nèi)氧化和抗氧化過程的平衡，多種因素聯(lián)合作用可加重機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展。

Ross[8]指出，AS是一種慢性炎癥性疾病。各種危險(xiǎn)因素?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使之表達(dá)各種趨化因子和粘附分子，介導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞粘附、聚集于內(nèi)膜損傷位點(diǎn)表面并移行增殖于內(nèi)膜下。激活的內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、白細(xì)胞介素(IL)-1等多種炎性細(xì)胞因子，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)效應(yīng)。ES組、PS組、NS組血清TNF-α均較NC組升高，特別是ES組升高明顯，提示心理應(yīng)激，生理應(yīng)激和高脂飲食均能引起大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，而心理應(yīng)激的影響更為嚴(yán)重。

TLR4突出的生物學(xué)活性是促進(jìn)機(jī)體內(nèi)炎性細(xì)胞因子的合成和釋放，引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)[9]。其不僅在AS斑塊組織中表達(dá)強(qiáng)烈，慢性炎癥過程亦可上調(diào)大血管組織中TLR4表達(dá)[10]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在出現(xiàn)早期AS病理改變的ES組大鼠以及沒有出現(xiàn)明顯組織學(xué)改變、但伴有氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)的PS、NS組大鼠，主動(dòng)脈TLR4表達(dá)均上調(diào)，提示TLR4參與了大血管早期炎性改變的發(fā)生。

Caso等[11]報(bào)道，TLR4可介導(dǎo)亞急性應(yīng)激后腦組織的炎性反應(yīng)。另有研究表明[12]，慢性應(yīng)激可通過TLR4-NF-κB途徑引起TNF-α等炎性因子的釋放，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。我們通過對(duì)四組大鼠主動(dòng)脈TLR4的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ES組大鼠主動(dòng)脈TLR4表達(dá)明顯增強(qiáng)，結(jié)合我們前面的討論，心理應(yīng)激可導(dǎo)致與AS密切相關(guān)的氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，提示TLR4可能部分介導(dǎo)了心理應(yīng)激導(dǎo)致的AS發(fā)病過程。它可能在體內(nèi)環(huán)境中的某些變化(如氧化應(yīng)激導(dǎo)致體內(nèi)慢性炎癥反應(yīng))和動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化之間起橋梁作用。雖然心理應(yīng)激引起AS炎癥反應(yīng)可能存在多方面機(jī)制，但ES組主動(dòng)脈TLR4表達(dá)上調(diào)也提示，心理應(yīng)激可能至少部分是通過TLR4的激活導(dǎo)致血管局部的炎癥反應(yīng)，而血管局部炎癥活動(dòng)是AS形成過程中最主要的特征，動(dòng)脈組織中出現(xiàn)炎癥因子表達(dá)增高可視為AS形成的一個(gè)早期信號(hào)。PS組主動(dòng)脈TLR4表達(dá)較NS組無(wú)明顯差異，考慮可能與生理應(yīng)激的強(qiáng)度或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物數(shù)量偏少有關(guān)。

TLR4是細(xì)菌脂多糖的關(guān)鍵受體。Kieran等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4介導(dǎo)了脂多糖誘導(dǎo)的單核細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，而抗氧化劑能夠抑制脂多糖所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子基因靶點(diǎn)活化，氧化應(yīng)激可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)節(jié)TLR4的表達(dá)，提示氧化應(yīng)激能夠影響TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。也有研究認(rèn)為低氧可通過內(nèi)皮細(xì)胞線粒體產(chǎn)生活性氧增多而下調(diào)TLR4表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)顯示，心理應(yīng)激在導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)的同時(shí)，主動(dòng)脈出現(xiàn)早期AS病理變化且TLR4表達(dá)增強(qiáng)，提示氧化應(yīng)激有可能在AS形成的早期，通過激活TLR4釋放TNF-α等炎性因子促進(jìn)血管壁的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)AS形成。

[1]Elenkov IJ,Chrousos GP.Stress system--organization,physiology and immunoregulation[J].Neuroimmunomodulation,2006,13(5-6):257-267.

[2]楊 蕾,李牧蔚,高傳玉.心理應(yīng)激對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠炎癥反應(yīng)的影響及意義[J].實(shí)用診斷與治療雜志,2007,21(5):354-356.

[3]Liu Y,Yu H,Zhang Y,et al.TLRs are important inflammatory factors in atherosclerosis and may be atherapeutic target[J].Med Hypotheses,2008,70(2):314-316.

[4]邵 楓,林文娟,陳極寰.慢性情緒應(yīng)激對(duì)大鼠行為的影響及變化趨勢(shì)[J].中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2003,12(1):5-6.

[5]Schulze PC,Lee RT.Oxidative stress and atheroselerosis[J].Curr Atheroscler Rep,2005,7(3):242-248.

[6]Mercanoglu G,Safran N,Uzun H,et al.Chronic emotional stress exposure increases infarct size in rats:the role of oxidative and nitrosative damage in response to sympathetic hyperactivity[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol,2008,30(10):745-752.

[7]鄭文卿,傅繼華,王 淵,等.長(zhǎng)期應(yīng)激結(jié)合高脂飼料對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈的損傷作用[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2009,26(2):170-174.

[8]Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease[J].N Engl J Med,1999,340(2):115-126.

[9]Diks SH,van Devente SJ,Peppelenbosch MP.Lipopolysaccharide recognition,internalisation,signalling and other cellular effects[J].J Endotoxin Res,2001,7(5):335-348.

[10]Kim F,Pham M,Luttrell I,et al.Toll-like receptor-4 mediates vascular inflammation and insulin resistance in diet-induced obesity[J].Circ Res,2007,100(11):1589-1596.

[11]Caso JR,Pradillo JM,Hurtado O,et al.Toll-like receptor 4 is involved in subacute stress-induced neuroinflammation and in the worsening ofexperimentalstroke [J].Stroke,2008,39(4):1314-1320.

[12]Wang RP,Yao Q,Xiao YB,et al.Toll-like receptor 4/nuclear factor-kappa B pathway is involved in myocardial injury in a rat chronic stress model[J].Stress,2011,14(5):567-575.

[13]Kieran AR,Michael FS,Jr MK,et al.Reactive oxygen and nitrogen Species differentially regulate Toll-Like Receptor 4-mediated activation of NF-kappa B and interleukin-8 expression[J].Infect Immun,2004,72(4):2123-2130.

[14]Ishida I,Kubo H,Suzuki S,et al.Hypoxia diminishes toll-like receptor 4 expression through reactive oxygen species generated by mitochondria in endothelial cells[J].J Immunol,2002,169(4):2069-2075.