段 莉，林典岳*

（1.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，海南 ?？?571101；2.海南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101）

破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，由單個(gè)核前體細(xì)胞融合而成。已有研究提示，在破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，受到包括血糖濃度在內(nèi)的多種微環(huán)境因素的調(diào)控[1]。同時(shí)，也有研究表明Notch信號(hào)是破骨細(xì)胞分化過(guò)程中重要信號(hào)通路之一[2-5]。目前，有關(guān)高糖濃度條件對(duì)破骨細(xì)胞分化及對(duì)Notch信號(hào)的影響還不清楚。因此，本研究旨在探討高糖條件下，破骨細(xì)胞的分化以及Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 試劑 α-MEM、特級(jí)胎牛血清，磷酸萘酚AS-MX，固紅紫色LB磷酸鹽(Sigma，美國(guó))；RANKL，M-CSF(Peprotech，美國(guó))；TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))；SYBR GREEN 試劑盒(Takara，日本)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 選用4周齡SD雄性大鼠，斷頸處死，無(wú)菌條件下分離完整股骨、脛骨，暴露髓腔后用α-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)沖洗骨髓腔數(shù)次至骨干發(fā)白為止。接種于10 cm培養(yǎng)皿，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)(飽和濕度、5%CO2、37℃)12 h 后收集非貼壁細(xì)胞，1 500 r/min，37℃離心5 min，棄上清，視為破骨前體細(xì)胞，加入M-CSF(20 ng/ml)和RANKL(30 ng/ml)誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化。

1.3 高濃度葡萄糖刺激 按照濃度依次增高的順序，設(shè)置0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L，40 mmol/L五個(gè)葡萄糖梯度，同時(shí)設(shè)置相對(duì)應(yīng)的甘露醇濃度，作為等滲對(duì)照。

1.4 抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色 將細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，4%福爾馬林固定液(Paraformal dehyde fixative)室溫固定10 min，PBS洗2次，甲醇(Methyl alcohol)和丙酮(Aceton)混合液(1:1)固定 3～5 min，PBS洗2次[TRAP染色液配方：N,N-二甲基甲酰胺(N-N-Dimethylformamide)500 μl，磷酸萘酚 AS-MX(Naphtol AS-MX phosphate)5 mg，TRAP緩沖液×50 ml；固紅紫色 LB 磷酸鹽(Fast red violet LB salt)30 mg]，37℃10 min，雙蒸水洗3次，光鏡觀察。多核(細(xì)胞核數(shù)目≥3個(gè))且TRAP染色陽(yáng)性的細(xì)胞視為破骨細(xì)胞。

1.5 RNA的提取、cDNA制備及實(shí)時(shí)定量PCR分析 用TRIzol試劑一步法抽提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA260/RNA280吸光度值以檢測(cè)RNA樣品的純度和濃度。按Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進(jìn)行RT-PCR[在 20 μl反應(yīng)體系中含 200 U MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，1×MMLV 緩沖液，20 U RNase，0.5 μg Oligo d(T)，2.5 mmol/L dNTP，1μg 總RNA模板]。cDNA合成在42℃進(jìn)行60 min，70℃滅活5 min。實(shí)時(shí)定量PCR分析用SYBR Green試劑盒。利用Primer Express 2.0設(shè)計(jì)針對(duì) Notch1、Notch2、Jagged1基因與β-actin引物如下：小鼠Notch1正義鏈5'-TCAATGCCGTGGATGACCTA-3'，反 義 鏈 5'-CCTTGTTGGCTCCGTTCTTC-3'；小鼠Notch2正義5'-CCCCTTG CCCTCTATGTACCA-3'，反 義 鏈 5'-GGTAGGTGGGAAAGCCACACT-3'；小鼠Jagged1正義鏈5'-CG GTGGCTGGGAAGGAA-3'，Jagged1 反義鏈5'-CTCGGGCCACACCAGAC-3'；β-actin 正義鏈 5'-TGAGA GGGAAATCGTGCGT-3'，反義鏈5'-GCTGGAAGGT GGACAGTGAG-3'。 利 用 2-ΔΔCT公 式 計(jì) 算 Notch1、Notch2和Jagged1相對(duì)于β-actin的基因表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，組間比較用SNK方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高濃度葡萄糖抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化 TRAP染色定量分析破骨細(xì)胞分化情況，每組重復(fù)三次。圖1示多核且TRAP染色為陽(yáng)性的破骨細(xì)胞。從圖2中可以看出，葡萄糖濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著葡萄糖濃度的繼續(xù)增高，破骨細(xì)胞數(shù)目減少，實(shí)驗(yàn)組(20 mmol/L葡萄糖)破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)為(110.3±6.81)，對(duì)照組(20 mmol/L甘露醇)破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)為(152.7±7.0)；當(dāng)葡萄糖濃度增高至40 mmol/L，實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)為(72.0±8.0)，而對(duì)照組(40 mmol/L甘露醇)破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)為(157±12.5)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果提示高糖環(huán)境可以抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。

圖1 破骨細(xì)胞顯微鏡下觀

圖2 高糖條件下RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的數(shù)量

2.2 高濃度葡萄糖抑制Notch2基因mRNA表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR定量分析Notch1，Notch2和Jagged1表達(dá)情況，每組重復(fù)3次。葡萄糖濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，Notch1、Notch2和Jagged1表達(dá)水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著葡萄糖濃度的繼續(xù)增高，Notch1和jagged1的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，但Notch2受體表達(dá)水平逐漸降低。實(shí)驗(yàn)組(20 mmol/L葡萄糖)Notch1、Notch2和Jagged1的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.25±0.43)，(1.65±0.23)和(1.16±0.38)，對(duì)照組(20 mmol/L甘露醇)Notch1、Notch2和Jagged1的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.84±0.38)，(2.82±0.28)，和(1.52±0.26)；當(dāng)葡萄糖濃度增高至40 mmol/L，實(shí)驗(yàn)組Notch1、Notch2和Jagged1的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.14±0.45)，(1.1±0.11)，(1.09±0.23)，對(duì)照組(40 mmol/L甘露醇)Notch1、Notch2和Jagged1的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.66±0.40)，(2.42±0.27)，(1.45±0.34)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間Notch2的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。該結(jié)果提示高糖環(huán)境抑制RANKL誘導(dǎo)Notch2表達(dá)。

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR分析高糖對(duì)RANKL誘導(dǎo)Notch1、Notch2和Jagged1表達(dá)的影響

3 討論

糖尿病和骨代謝疾病(如骨質(zhì)疏松)是影響人類生活健康的兩大常見(jiàn)疾患，二者發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，骨骼亦是糖尿病慢性并發(fā)癥的受累器官之一[6-7]。眾多研究已證實(shí)，高血糖狀態(tài)引發(fā)骨質(zhì)疏松主要是通過(guò)抑制成骨細(xì)胞的骨形成過(guò)程[8]。但是，有關(guān)高血糖狀態(tài)下骨代謝過(guò)程中另外一個(gè)主要功能細(xì)胞-破骨細(xì)胞的研究較少。

正常成人在生理狀態(tài)下，通過(guò)破骨細(xì)胞的骨質(zhì)再吸收和成骨細(xì)胞精確協(xié)調(diào)，保持骨質(zhì)的不斷更新。破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化及其骨吸收過(guò)程中，受到破骨細(xì)胞活化因子(如RANKL)及破骨細(xì)胞抑制因子系統(tǒng)(如OPG)的精密調(diào)控[9]，同時(shí)，也需要葡萄糖作為基本的能量代謝物質(zhì)。人體內(nèi)正常血糖濃度大約為5.5 mmol/L，因此本實(shí)驗(yàn)選擇葡萄糖濃度為5.0 mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L，40 mmol/L的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)破骨前體細(xì)胞。從本研究結(jié)果可以看出，各組均有破骨細(xì)胞形成，隨著葡萄糖濃度的增高，多數(shù)實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞的數(shù)量少于對(duì)照組，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該研究結(jié)果與Wittrant等[1]的報(bào)道一致。本研究提示RANKL能誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，而高糖環(huán)境可以抑制破骨細(xì)胞分化，并且呈現(xiàn)出濃度依賴性，總體趨勢(shì)是濃度越大，抑制破骨細(xì)胞分化的能力越強(qiáng)。

基于Notch信號(hào)在生物進(jìn)化中的保守性及其作用的廣泛性[10]，本研究欲初步探討高糖條件下破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，Notch信號(hào)通路基因的相關(guān)變化情況。Notch基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，該基因的部分功能缺失會(huì)在果蠅翅膀的邊緣造成缺口(Notch)，Notch基因由此而得名。脊椎動(dòng)物中有4個(gè)Notch同源體：Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。Notch配體共有5種，分為兩個(gè)家族：Jagged 家族(Jagged1、Jagged2)和Delta-like家族(Delta1、Delta3和Delta4)。最新研究表明Notch2受體與配體Dll1結(jié)合后，正向調(diào)控破骨細(xì)胞分化過(guò)程；而Notch1受體與Jagged1配體結(jié)合負(fù)向調(diào)控破骨細(xì)胞分化過(guò)程[2]。本實(shí)驗(yàn)研究主要檢測(cè)高糖條件下，RANKL誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞表面Notch1、Notch2、Jagged1的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明RANKL促進(jìn)破骨前體細(xì)胞Notch1、Notch2、Jagged1基因的mRNA表達(dá)水平，該研究結(jié)果與一些學(xué)者[3-5]報(bào)道一致。但隨著葡萄糖濃度的增高，實(shí)驗(yàn)組Notch2的表達(dá)水平低于對(duì)照組，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明RANKL能提高細(xì)胞Notch2的表達(dá)水平，而高糖環(huán)境抑制Notch2的表達(dá)，提示Notch2信號(hào)可能參與調(diào)控高糖環(huán)境下RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過(guò)程。然而，在高糖條件下，有關(guān)Notch信號(hào)途徑中受體與配體具體相互作用方式與及其機(jī)制尚不明確。因此，針對(duì)高糖條件下Notch信號(hào)在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中的作用需進(jìn)一步研究探討。

[1]Wittrant Y,Gorin Y,Woodruff K,et al.High d(+)glucose concentration inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis[J].Bone,2008,42(6):1122-1130.

[2]Sekine C,Koyanagi A,Koyama N,et al.Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes[J].Arthritis Res Ther,2012,14(2):45.

[3]Yamada T,Yamazaki H,Yamane T,et al.Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells[J].Blood,2003,101(6):2227-2234.

[4]Bai S,Kopan R,Zou W,et al.NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells[J].J Biol Chem,2008,283(10):6509-6518.

[5]Fukushima H,Nakao A,Okamoto F,et al.The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKLinduced osteoclastogenesis[J].Mol Cell Biol,2008,28(20):6402-6412.

[6]Schwartz AV,Sellmeyer DE.Diabetes,fracture,and bone fragility[J].Curr Osteoporos Rep,2007,5(3):105-111.

[7]Adami S.Bone health in diabetes:considerations for clinical management[J].Curr Med Res Opin,2009,25(5):1057-1072.

[8]Wang W,Zhang X,Zheng J,et al.High glucose stimulates adipogenic and inhibits osteogenic differentiation in MG-63 cells through cAMP/protein kinase A/extracellular signal-regulated kinase pathway[J].Mol Cell Biochem,2010,338(1-2):115-122.

[9]Boyce BF,Xing L.Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling[J].Arch Biochem Biophys,2008,473(2):139-146.

[10]Bray SJ.Notch signalling:a simple pathway becomes complex[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7(9):678-689.