佘文莉 陸 紅 黃海玲 劉 暉 劉宏偉 謝光輝 謝 珊

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形激光美容科，廣東 廣州 510630)

Bowen病亦稱原位鱗狀細(xì)胞癌，為發(fā)生于皮膚或黏膜的表皮內(nèi)鱗狀細(xì)胞癌，最有效的治療為手術(shù)切除，皮損較小時可采用電燒灼、冷凍或激光及液氮冷凍治療。有研究將5-氨基酮戊酸(ALA)-光動力療法(PDT)用于治療老年 Bowen病〔1〕、慢性斑塊型銀屑病〔2〕、尖銳濕疣等皮膚疾病〔3〕，認(rèn)為必須首先明確應(yīng)用該法時影響透皮吸收和生物利用度的重要因素。本研究以迷你豬動物模型為基礎(chǔ)，采用熒光檢測法觀察局部ALA-PDT療法在不同封包條件(溫度、溶劑、PH值、角質(zhì)軟化劑)下的透皮吸收和生物利用度(皮膚組織攝取ALA和轉(zhuǎn)化PpIX能力)，分析找出局部ALA外用的最佳方法，并將其應(yīng)用于臨床治療老年Bowen病，為ALA-PDT的推廣應(yīng)用提供指導(dǎo)性意見。

1 材料與方法

1.1 動物實驗

1.1.1 建立迷你家豬動物模型 選取大小相近、體重10.0～15.0 kg、3～4月齡的迷你家豬，用相應(yīng)劑量的戊巴比妥鈉麻醉，隨機分組，用龍膽紫溶液在每只動物背部皮膚標(biāo)記實驗區(qū)域。封包，在各模型組動物實驗區(qū)域取組織3.0 g，制成細(xì)胞懸液，用熒光分光光度計檢測標(biāo)本中的熒光強度〔4，5〕。每組實驗均設(shè)傳統(tǒng)組，試劑為不含ALA的等量水溶劑。相對熒光強度(RFI)計算方法為:RFI=優(yōu)化組平均熒光強度/傳統(tǒng)組平均熒光強度。

1.1.2 不同封包溫度ALA對透皮吸收和轉(zhuǎn)化的影響 將20%的5-ALA水溶劑在避光條件下涂在標(biāo)記處，用塑料薄膜避光封包。然后將動物恒溫毯分別設(shè)置37℃、42℃，置于ALA涂抹處分別封包1、3、6、12 h，熒光光譜法檢測組織中光敏劑原卟啉Ⅸ(PpⅨ)的含量。

1.1.3 不同溶劑ALA對透皮吸收和轉(zhuǎn)化的影響 分別用生理鹽水及2%月桂氮艸卓酮(Azone)制備20%的5-ALA溶液，在避光條件下涂在標(biāo)記處，用塑料薄膜避光封包。分別封包1、3、6、12 h，熒光光譜法檢測組織中光敏劑PpⅨ的含量。

1.1.4 有無使用角質(zhì)軟化劑ALA對透皮吸收和轉(zhuǎn)化的影響10%水楊酸溶液預(yù)涂皮膚實驗區(qū)域30 min，然后將20%的5-ALA水溶劑在避光條件下涂在標(biāo)記處，用塑料薄膜避光封包。分別封包1、3、6、12 h，熒光光譜法檢測組織中光敏劑 PpⅨ的含量。

1.1.5 不同pH值制劑ALA對透皮吸收和轉(zhuǎn)化的影響 分別以枸櫞酸鹽緩沖液(pH4.0)、磷酸鹽緩沖液(pH7.0)、硼酸-氯化鉀緩沖液(pH9.0)，配制成pH值4.0、7.0、9.0的ALA制劑，在避光條件下涂在標(biāo)記處，用塑料薄膜避光封包。分別封包1、3、6、12 h，熒光光譜法檢測組織中光敏劑PpⅨ的含量。

1.2 臨床實驗 將上述實驗得到的最佳封包方式應(yīng)用于治療老年Bowen病患者。選取我院收治的6例老年Bowen病患者，隨機分配到兩組，年齡范圍58～75歲，平均(62±6.9)歲;其中男4名，女2名;病程6個月～5年，平均42.1個月;皮損分布于腿、背、手和前額等部位。優(yōu)化組采用上述動物實驗得到的最佳封包方法，傳統(tǒng)組采用目前臨床常用的治療方法。將皮膚表面的鱗屑或痂皮利用醫(yī)用膠帶去除，治療前將ALA(Sigma，美國)溶于特定pH的水性乳霜中，配成20%ALA霜劑，輕柔地涂布在皮損表面及其周圍1 cm，以塑料薄膜封包，外面貼上適當(dāng)大小的鋁箔，囑患者于黑暗環(huán)境中避光3～4 h(傳統(tǒng)組)或特定時間(優(yōu)化組)，依據(jù)腫瘤大小確定照射面積，選用630 nm的ALA-PDT治療儀(博激世紀(jì)科技有限公司，武漢)照射，照射時間約30 min，照射劑量為50 J/cm2。上述光動力治療每周2次，連續(xù)治療4 w后行皮膚活組織切片檢察，臨床常規(guī)檢查確定治療效果和最佳封包方式。所有病例均隨訪6個月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，兩組間樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組樣本比較采用方差分析。相關(guān)性研究采用Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(所有數(shù)據(jù)均以±s表示)。

2 結(jié)果

2.1 動物實驗 對動物實驗部分得到的不同封包條件下熒光光譜法檢測組織中光敏劑含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計研究，見圖1。溫度對光敏劑的透皮吸收效率有顯著影響(P＜0.05)，37℃條件下ALA透皮吸收和轉(zhuǎn)化效率在12 h時達(dá)到最大吸收。用生理鹽水或2%月桂氮艸卓酮制備20%的5-ALA，其熒光強度并無顯著差異。有無使用角質(zhì)軟化劑對透皮吸收和轉(zhuǎn)化效率，同樣無顯著影響。不同pH值制劑中，pH4.0的制劑吸收轉(zhuǎn)化效率最高，隨著制劑pH升高，其透皮吸收和轉(zhuǎn)化效率顯著降低(P＜0.05)。分析實驗結(jié)果，封包3 h后ALA吸收速率減慢，6 h后已接近平臺期，改變前三個變量時封包6 h與12 h療效差異不大，但是在pH改變時卻出現(xiàn)了顯著差異(P＜0.05)，這使得封包條件由目前臨床的3～4 h增加到12 h，雖然給患者造成了一些不便，卻能顯著提升ALA的吸收效率和生物利用度。

圖1 不同封包條件下熒光光譜法檢測組織中PpⅨ含量

2.2 體內(nèi)實驗 優(yōu)化組采用生理鹽水制備的20%的pH4.0的5-ALA制劑，在37℃下避光封包12 h的治療方法。優(yōu)化組3例患者經(jīng)過上述治療后，皮損消退，未留明顯瘢痕。傳統(tǒng)組中2例患者皮損消退，其中1例患者治療效果不佳，仍具有明顯瘢痕且復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為33.3%(1/3)。

3 討論

十多項開放研究和隨機對照研究已經(jīng)證實，一次ALA-PDT用于治療Bowen病的治愈率為86%(71/83)，2～3次治療后升高到93%(239/257)，隨訪 3～36個月后復(fù)發(fā)率平均為12%〔6，7〕。本實驗以迷你豬動物模型為基礎(chǔ)，采用熒光檢測法觀察局部ALA-PDT療法在不同封包條件(溫度、溶劑、pH值、角質(zhì)軟化劑)下的透皮吸收和生物利用度(皮膚組織攝取ALA和轉(zhuǎn)化PpⅨ的能力)的差異，找出局部ALA外用的最佳方法，并選取最佳方式用于臨床治療老年Bowen病，與傳統(tǒng)治療相比，雖然增加了封包時間，但是卻使采用該法治療Bowen病的效果更顯著，復(fù)發(fā)率降低，為ALA-PDT的推廣應(yīng)用提供指導(dǎo)性意見。

1 頡玉勝，彭學(xué)標(biāo)，范文成，等.5-氨基酮戊酸光動力療法(ALA-PDT)治療老年面部Bowen病的療效觀察〔J〕.中國美容醫(yī)學(xué)，2011;20(6):959-60.

2 李康英，羅 東.ALA-PDT治療銀屑病機制與臨床研究的新進(jìn)展〔J〕.應(yīng)用激光，2010;30(3):246-8.

3 侯淑萍，齊蔓莉，亓玉青，等.5-氨基酮戊酸-光動力療法治療尖銳濕疣和皮膚腫瘤的療效觀察〔J〕.天津醫(yī)藥，2009;37(9):791-2.

4 李曉松，顧 瑛，劉凡光，等.光動力學(xué)療法治療過程中鮮紅斑痣病變組織內(nèi)光敏劑含量檢測的初步研究〔J〕.中國激光醫(yī)學(xué)雜志，2007;16(2):82-7.

5 謝光輝，李康英，劉宏偉，等.ALA-PDT對正常人角質(zhì)形成細(xì)胞生物效應(yīng)的實驗研究〔J〕.激光生物學(xué)報，2011;20(3):309-14.

6 Morton CA，Brown SB，Collins S，et al.Guidelines for topical photodynamic therapy:report of a workshop of the British Photodermatology Group〔J〕.Br J Dermatol，2002;146(4):552-67.

7 Sieroń A，Kwiatek S.Twenty years of experience with PDD and PDT in Poland〔J〕.Photodiag Photodynam Ther，2009;6(2):73-8.