劉利則 夏 莉 段北野 劉玉俠 (吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 3002)

盡管少數(shù)早期肺癌患者可以通過手術治療達到根治的效果，但70%的非小細胞肺癌(NSCLC)患者確診時已屬臨床晚期，無法通過手術治愈。含鉑類雙藥化療方案是晚期NSCLC標準的一線化療方案，其中順鉑(cDDP)是使用廣泛的化療藥物之一〔1〕。但是隨著治療的進行，腫瘤細胞會對化療藥物產(chǎn)生耐藥，這是造成化療療效不佳及失敗的主要原因之一〔2〕。如何保持腫瘤細胞對化療藥物的敏感性是廣大腫瘤工作者研究的課題。本實驗擬建立人肺腺癌A549耐藥細胞系，為藥物逆轉(zhuǎn)細胞耐藥提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 IMDM培養(yǎng)基:Gibco產(chǎn)品;噻唑藍(MTT):Sigma產(chǎn)品;胎牛血清:天津TB公司;二甲基亞砜(DMSO):Sigma產(chǎn)品;順鉑:購于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司;瓊脂糖、DNA標準品:寶泰克公司產(chǎn)品。

1.1.2 人肺腺癌細胞系A549 購于上海生命科學研究院。

1.1.3 主要設備及器材 低溫低速離心機，SORVALL RTT，USA;全自動酶標儀，Labsystems Dragon;萬能視頻成像系統(tǒng)(LY-WN-HPCCD)都勵揚精密機電有限公司。

1.2 實驗方法.

1.2.1 細胞復蘇與培養(yǎng) 將A549細胞從液氮罐中取出復蘇后，加入含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 耐藥細胞株A549/cDDP建立 當細胞處于指數(shù)生長期且已鋪滿瓶底80%以上時，棄去原來培養(yǎng)液，加入含順鉑培養(yǎng)液(終濃度為100 μmol/L)，培養(yǎng)1 h后棄去含順鉑培養(yǎng)基，更換為新鮮配制的含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)，拍照。待細胞長滿瓶時，用0.25%胰酶消化傳代。再長滿瓶底時再用同樣濃度同樣方法沖擊，再培養(yǎng)并觀察細胞生長狀態(tài)，拍照，再傳代。如此，體外連續(xù)培養(yǎng)、沖擊、傳代，并同時進行抗藥性檢測。反復凍存，復蘇，觀察細胞株生長穩(wěn)定性。

1.2.3 MTT法檢測細胞抗藥性 復蘇人肺腺癌細胞株A549和經(jīng)過順鉑沖擊處理的A549/cDDP細胞，用含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液重懸，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞生長至指數(shù)生長期時，0.25%胰酶消化，生理鹽水洗滌，計數(shù)。用含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為5×104/ml，加入 96 孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，置于 CO2培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)過夜，細胞貼壁后加入受試藥物cDDP，終濃度分別是 200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，同時設陰性對照(以等體積的生理鹽水代之)和空白對照(無細胞)。各組設6復孔。37℃、5%CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)72 h后加入 MTT(5 mg/ml)，20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)上清。加入DMSO，150 μl/孔，振蕩10 min，使結晶物全部溶解后，用全自動酶標儀檢測各孔吸光度值(A)，波長為492 nm。求出不同濃度cDDP對兩種細胞的抑制率。計算公式:抑制率=〔1－(實驗組均值/陰性對照組均值)〕×100%;計算50%細胞生長抑制所需的藥物濃度(IC50)和耐藥指數(shù)(RI)。RI=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.2.4 A549順鉑耐藥細胞基因檢測 檢測多藥耐藥基因特異序列(167 bp)的表達，用PCR擴增法。引物設計:上游CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG，下游GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA。PCR擴增:在離心管內(nèi)加入下列內(nèi)容物:10倍緩沖液，2.5 μl;MgCl2，2.5 μl;dNTP(2 mmol/L)，2.5 μl;引物，1.0 μl;DDW，14.0 μl;Target，2.0 μl;95℃，5 min 后加 Tag，0.5 μl。94℃，30 s;55℃，60 s;72℃，70 s;共 30 個循環(huán)，72℃ 延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測多藥耐藥基因特異片段(167 bp)。

2 結果

2.1 細胞生長狀態(tài)及生長特征 細胞在接受大劑量cDDP沖擊后，出現(xiàn)大量死亡細胞，活細胞數(shù)銳減;生長緩慢，出現(xiàn)單個細胞克隆，層疊生長，傳代后恢復單層排列。再次大劑量沖擊后殘存細胞再次層疊生長，傳代后依然恢復單層排列。A549細胞經(jīng)大劑量cDDP反復沖擊后，細胞生長變緩慢，細胞體積變大，邊界清楚。見圖1。

圖1 經(jīng)大劑量cDDP沖擊后細胞生長狀態(tài)

2.2 不同次數(shù)cDDP沖擊后細胞耐藥性測定結果 分別檢測經(jīng)大劑量cDDP沖擊10次和12次以后，不同濃度cDDP對親本細胞和耐藥誘導細胞的生長抑制情況。見表1，表2。沖擊10次時對照組和 A549細胞的 IC50分別為24.33、65.65 μmol/L，RI為2.7;沖擊12次時對照組和 A549細胞的IC50 分別為 19.61、81.58 μmol/L，RI為 4.2。

2.3 多藥耐藥基因特異片段(167 bp)的檢測結果 見圖2。從電泳結果可見，在167 bp附近有一條泳帶。證明提取人肺腺癌細胞A549順鉑耐藥細胞有多藥耐藥特異基因的表達。

表1 大劑量cDDP沖擊10次后A549/cDDP細胞的藥物檢測(±s)

表1 大劑量cDDP沖擊10次后A549/cDDP細胞的藥物檢測(±s)

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表2 大劑量cDDP沖擊12次后A549/cDDP細胞的藥物檢測(±s)

表2 大劑量cDDP沖擊12次后A549/cDDP細胞的藥物檢測(±s)

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圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測多藥耐藥基因PCR擴增片段

3 討論

目前，晚期NSCLC一線標準化療方案是兩種三代含鉑藥物聯(lián)合。順鉑具有類似烷化劑雙功能基團，與細胞內(nèi)親核基團結合，主要與DNA鏈上的堿基作用，改變其正常復制模板的功能，引起DNA復制障礙，從而抑制癌細胞分裂。

多藥耐藥是指腫瘤細胞對結構和功能不同的多種藥物都產(chǎn)生了耐藥。多藥耐藥的發(fā)展源于單用高劑量給藥或聯(lián)合用藥后存活下來的部分細胞〔3，4〕。根據(jù)這一原理，本實驗通過用順鉑反復沖擊人肺腺癌A549細胞，建立人肺腺癌A549順鉑耐藥細胞系，為藥物逆轉(zhuǎn)耐藥細胞提供實驗基礎。

本文結果證明，經(jīng)10次和12次沖擊后，A549細胞對順鉑具有較強的耐受力，A549/DDP耐藥細胞內(nèi)有耐藥基因的表達。因此，本實驗建立了A549/DDP耐藥細胞株。該細胞株通過反復凍存、復蘇后，仍能高表達耐藥基因，具有很好穩(wěn)定性，為藥物逆轉(zhuǎn)實驗奠定了基礎。

1 Triano LR，Deshpande H，Gettinger SN.Management of patients with advanced non-small cell lung cancer:current and emerging options〔J〕.Drugs，2010;70(2):167-79.

2 Aandrews J，Yeh P，Pao W，et al.Molecular predictors of response to chemotherapy in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer J，2011;17(2):104-13.

3 Jabr-Milanc LS，van Vlerken LE，Yadav S，et al.Multi-functional nanocarriers to overcome tumor drug resistence〔J〕.Cancer Treat Rev，2008;34(7):592.

4 Meijerman I，Beijnen JH，Schellens JH，et al.Combined action and regulation of phageⅡenzymes and multidrug resistence proteins in multidrug resistence in cancer〔J〕.Cancer Treat Rev，2008;34(6):505.