郭燕君 (嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

人類cathepsin L基因定位于第9號(hào)染色體9q21-22，屬于半胱氨酸蛋白酶的家族成員之一，是一種廣泛存在的嗜酸性溶酶體蛋白水解酶。翻譯后N-端糖基化，利用6-磷酸-甘露糖受體而定位于溶酶體，并以酶原形式存在，其前體沒有活性，在受到刺激時(shí)可以被其他蛋白水解酶水解或者自身激活，其主要分布于溶酶體，也有極少部分定位于細(xì)胞核。在一定條件下會(huì)從溶酶體釋放到胞質(zhì)，也會(huì)釋放到細(xì)胞外。有研究表明，在阿爾茨海默病(AD)患者的老年斑中，cathepsin L細(xì)胞外水平明顯升高〔1，2〕，溶酶體和細(xì)胞膜的不完整導(dǎo)致cathepsin L的異常定位在老齡相關(guān)疾病和AD的發(fā)病中起重要作用。cathepsin L在AD中的表達(dá)國內(nèi)尚無報(bào)道。本研究通過建立β-淀粉樣蛋白(Aβ)大鼠海馬注射制作AD動(dòng)物模型，觀察cathepsin L在AD大鼠腦組織中的表達(dá)，探討其在AD中的意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠，體重(230±20)g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。用Y-迷宮測試判定其空間辨別性學(xué)習(xí)記憶能力，淘汰反應(yīng)過于遲鈍或特別敏感的大鼠，將選出的大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和模型組，每組8只。

1.2 試劑和儀器 Aβ25～35(Sigma公司)、cathepsin L鼠抗單克隆抗體(Bio-Rad公司)、羊抗鼠標(biāo)記的異硫氰酸熒光素(FITC)(北京中山生物技術(shù)公司)、Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院產(chǎn)品)、腦立體定位儀(NAR ISA IGE SN-2)。

1.3 模型制備 模型組大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，頭部固定在腦立體定位儀上，剪毛消毒，在頭背中部縱向切口，暴露顱骨，定位坐標(biāo):雙側(cè)海馬區(qū)注射點(diǎn)(AP－3.5 mm，ML±2.0 mm，DV 2.7 mm)用微量進(jìn)樣器(上海高欣玻璃儀器廠產(chǎn)品)注射 5 μl(10 μg)Aβ25～35(聚集態(tài)的 Aβ25～35形成)，10 min內(nèi)注完。假手術(shù)組注射等量的生理鹽水。慶大霉素消毒，縫合皮膚。1 w后進(jìn)行行為學(xué)檢測。假手術(shù)組除不注射 Aβ25～35外，其余步驟同模型組;正常組大鼠不做任何處理。

1.4 行為學(xué)檢測 模型制備7 d后，用Y-迷宮進(jìn)行行為記憶觀察。對各組大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)獲得能力次數(shù)測試和記憶再現(xiàn)次數(shù)測試。

1.5 標(biāo)本的收集 行為測試后，大鼠用10%水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉，并用4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行心臟灌流，之后取出大腦放入大鼠腦模具中進(jìn)行冠狀切開，取各組相同斷面進(jìn)行連續(xù)切片并進(jìn)行免疫熒光染色。

1.6 HE染色 切片置于室溫下干燥30 min后，分別放入蘇木素和伊紅染液中進(jìn)行染色。

1.7 cathepsin L免疫熒光染色 將腦片用振動(dòng)切片機(jī)切成30 μm厚的切片，之后根據(jù)免疫熒光染色操作說明書進(jìn)行染色。各組實(shí)驗(yàn)均以不加第一抗體作陰性空白對照。cathepsin L陽性物質(zhì)呈紅色熒光。

1.8 cathepsin L表達(dá)的檢測 隨機(jī)抽取各組大鼠5只麻醉后快速斷頭，在冰上取新鮮海馬組織，剪碎后加1∶10裂解液，勻漿，17 000 r/min 4℃離心1 h，取上清液用考馬思亮藍(lán)G250結(jié)合法測蛋白含量，根據(jù)已知牛血清白蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計(jì)算樣品蛋白濃度。SDS-PAGE電泳:凝膠濃度為7.5%，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉TTBS緩沖液震蕩封閉3 h，將膜移入雜交袋中，加入用封閉液稀釋的1∶300 一抗 4℃ 過夜，β-actin(1∶300 購于 Santa Cruz公司)，洗膜。加入用封閉液稀釋的1∶500二抗(羊抗鼠IgG購于Santa Cruz公司)，室溫反應(yīng)1 h，洗膜。洗膜后進(jìn)行ECL(購于Santa Cruz公司)反應(yīng)1～3 min。在暗室內(nèi)曝光顯影后沖洗膠片，凝膠成像分析系統(tǒng)攝影分析。

1.9 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將熒光顯微鏡下所攝cathepsin L陽性神經(jīng)元照片用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(HM IAS)記錄陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，并記錄陽性細(xì)胞百分率;Western印跡檢測蛋白帶應(yīng)用Metamorph圖像分析系統(tǒng)和Bio 2RAD Gel2000光密度掃描儀進(jìn)行光密度掃描測定，計(jì)算整合光密度值(IDV)，計(jì)算出各組樣品目標(biāo)帶與β-actin IDV比值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)改變 見表1。模型組大鼠的學(xué)習(xí)所需次數(shù)和記憶再現(xiàn)所需次數(shù)均長于正常組(P＜0.01)，而假手術(shù)組與正常組在學(xué)習(xí)所需次數(shù)和記憶再現(xiàn)所需次數(shù)上無明顯差異，說明Aβ25～35對學(xué)習(xí)記憶的獲得和記憶再現(xiàn)均有影響。

2.2 HE染色 AD組大鼠海馬注射針道附近可見細(xì)胞增生、聚集，核小深染，成扁圓形，判斷為膠質(zhì)細(xì)胞。CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯減少，可見大量腫脹及圓齒形神經(jīng)元，核邊聚、碎裂，成凋亡趨勢，局部神經(jīng)元大段缺失，膠質(zhì)細(xì)胞增生(圖1)。假手術(shù)組海馬神經(jīng)元輕度受損(圖1)，與AD組比較有顯著差異。

表1 兩組行為學(xué)測試(n=8，±s)

表1 兩組行為學(xué)測試(n=8，±s)

與正常組比較:1)P＜0.01

組別 學(xué)習(xí)獲得能力次數(shù) 記憶再現(xiàn)次數(shù)正常組9.3 ±2.46 4.2 ±0.4模型組 26.7±5.11) 21.1 ±3.11)假手術(shù)組12.8±2.2 5.8 ±0.3

圖1 兩組大鼠海馬神經(jīng)元(HE，×400)

2.3 cathepsin L蛋白熒光檢測 見表2、圖2。cathepsin L蛋白熒光檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠在cathepsin L陽性神經(jīng)元數(shù)量和陽性細(xì)胞百分率上均高于正常組大鼠(P＜0.05)。

表2 cathepsin L陽性神經(jīng)元的表達(dá)(n=8，±s)

表2 cathepsin L陽性神經(jīng)元的表達(dá)(n=8，±s)

與正常組比較:1)P＜0.05

組別 神經(jīng)元數(shù)量 百分率(%)正常組7.4 ±2.1 15.9±1.17模型組 31.5±4.81) 34.6±0.951)假手術(shù)組9.6±5.3 16.9±0.64

圖2 大鼠海馬神經(jīng)元cathepsin L蛋白表達(dá)(FITC，×400)

2.4 cathepsin L蛋白Western印跡檢測 見圖3。cathepsin L蛋白印記分析顯示，模型組大鼠的cathepsin L蛋白印記條帶DV值高于正常組〔(0.35±0.46)vs(0.14±0.02)，P＜0.01〕，而假手術(shù)組與正常組大鼠的cathepsin L蛋白印記條帶IDV值無明顯差異〔(0.14±0.02)，P＞0.05〕。

圖3 Cathepsin L蛋白Western印跡結(jié)果

3 討論

AD的病理特征是腦內(nèi)神經(jīng)元出現(xiàn)大量的老年斑(SP)。本研究采用Aβ25～35海馬內(nèi) CA1區(qū)注射造成Aβ沉積的AD模型，模型組大鼠的學(xué)習(xí)所需次數(shù)和記憶再現(xiàn)所需次數(shù)均長于正常組，模型組大鼠可見大鼠海馬注射針道附近可見細(xì)胞增生、聚集，核小深染，成扁圓形，判斷為膠質(zhì)細(xì)胞。CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯減少，可見大量腫脹及圓齒形神經(jīng)元，核邊聚、碎裂，成凋亡趨勢，局部神經(jīng)元大段缺失，膠質(zhì)細(xì)胞增生，在行為學(xué)和病理改變上證明模型是成功的。

cathepsin L的主要功能是降解和更新細(xì)胞內(nèi)的蛋白，它在溶酶體降解蛋白的過程中發(fā)揮著重要作用，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白保持動(dòng)態(tài)平衡，從而參與了機(jī)體很多正常的生理活動(dòng)。研究證明其在神經(jīng)遞質(zhì)的加工處理〔3，4〕，抗原呈遞〔5〕、組織器官的發(fā)育等方面起著重要作用。近來研究證明，cathepsin L與神經(jīng)退行性疾病，如AD密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)AD大鼠海馬區(qū)cathepsin L陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，提示cathepsin L的表達(dá)水平升高與海馬神經(jīng)元退行性變有關(guān)。已經(jīng)有研究證明cathepsin L參與了caspase-3的激活〔6〕，并對神經(jīng)元的凋亡具有調(diào)節(jié)作用，但是參與的詳細(xì)機(jī)制仍不明確。

cathepsin L參與海馬神經(jīng)元死亡的可能機(jī)制是，cathepsin L參與了小膠質(zhì)細(xì)胞激活所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在神經(jīng)退行性疾病中作用一直受到重視。研究已證實(shí)用刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，cathepsin L表達(dá)升高，且參與了小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)元的死亡過程〔2〕。可見，溶酶體蛋白酶cathepsin L的表達(dá)、分部及活性的改變既可以在神經(jīng)元內(nèi)參與凋亡，還可以在小膠質(zhì)細(xì)胞的激活過程中發(fā)揮作用，其在AD中的具體作用及機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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