王麗娟 (赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

阿爾茨海默病(AD)臨床癥狀的特征是記憶和其他認(rèn)知功能顯著減退，導(dǎo)致患者無法正常思考和判斷，必須由他人照料生活。隨著人類平均壽命延長(zhǎng)和人口老齡化的出現(xiàn)，AD對(duì)人類健康的危害變得日益突出，是威脅老年人生命健康的高發(fā)病。但由于各種技術(shù)上的原因，AD的治療尚未取得突破性進(jìn)展。成體干細(xì)胞的多潛能性為AD的治療提供了新的思路和方法〔1〕。本實(shí)驗(yàn)主要觀察定向誘導(dǎo)前后的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB－MSCs)海馬移植對(duì)AD模型大鼠行為學(xué)的影響，旨在尋找出最佳治療方案，為AD的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料 健康雄性Wistar大鼠40只，鼠齡6個(gè)月，質(zhì)量 (400±20)g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。新鮮臍血由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。在征得產(chǎn)婦同意后，無菌條件下采集新生兒臍血，用肝素抗凝。IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，β－巰基乙醇、纖維結(jié)合素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，抗ChAT抗體購(gòu)自CHEMICON公司，腦立體定位儀購(gòu)自日本光電公司，MG－2型迷宮購(gòu)自張家港市生物儀器廠，氫溴酸東莨菪堿注射液購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司，規(guī)格1 ml∶0.3 mg，D－半乳糖購(gòu)自Amresco公司，用時(shí)2.5 g溶于250 ml生理鹽水中。氯化鋁購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的制備 選用Wistar大鼠依據(jù)文獻(xiàn)〔2，3〕建立動(dòng)物模型。方法如下:動(dòng)物采用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w以后，大鼠每日D－半乳糖腹腔注射50mg/kg及20 mg/ml AlCl3，2 ml，每日1次，連續(xù)6 w，同時(shí)在普通飼料的基礎(chǔ)上，按體重8%的進(jìn)食量添加AlCl3·6H2O，劑量111.9 mg/kg體重，喂飼90 d，采用Y－電迷宮儀訓(xùn)練和測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前10 min，一次性腹腔注射氫溴酸東莨菪堿2 mg/kg，讓大鼠在迷路箱內(nèi)適應(yīng)3 min，順時(shí)針給予燈光刺激(燈光區(qū)為安全區(qū)，其余為刺激區(qū))，待其逃避至安全區(qū)，燈光繼續(xù)作用15 s，然后停燈休息1 min，再給予第2次刺激，依次重復(fù)40次，大鼠在10 s內(nèi)從刺激區(qū)一次性跑向安全區(qū)即被判為正確，否則均判為錯(cuò)誤.記錄正確與錯(cuò)誤的次數(shù)。滿分為100分，每出錯(cuò)1次2.5分。學(xué)習(xí)48 h后進(jìn)行記憶測(cè)試，方法同上。學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)均在50分以下者為成功模型大鼠。40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、hUCB－MSCs移植組、常氧分化移植組和低氧分化移植組，每組10只。

1.3 人hUCB－MSCs的培養(yǎng)及向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化依據(jù)文獻(xiàn)〔4〕培養(yǎng)人 hUCB－MSCs，待細(xì)胞匯合約達(dá)70%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按2.0×106/皿密度接種于涂有纖維結(jié)合素的35 mm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分3組，即hUCB－MSCs組、常氧分化組和低氧分化組，每組6皿。臍血MSCs組、常氧分化組細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱常氧培養(yǎng);低氧分化組細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)為3%O2的環(huán)境中培養(yǎng)。分化組于接種24 h后棄去培養(yǎng)液，用解剖液洗2次，加入預(yù)誘導(dǎo)液(IMDM+20%胎牛血清+1%L谷氨酰胺+1%雙抗+終濃度1 mmol/L BME);預(yù)誘導(dǎo)24 h后棄去預(yù)誘導(dǎo)液，用解剖液洗2次，再加入誘導(dǎo)液(IMDM+1%L谷氨酰胺+1%N2+1%雙抗+終濃度5 mmol/LBME)誘導(dǎo)5 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，將3組細(xì)胞同時(shí)固定，然后進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定。按2×106個(gè)/瓶密度接種于涂有纖維結(jié)合素的75 cm2培養(yǎng)瓶中，分組及分化方法同上，每組5瓶，用于細(xì)胞移植。

1.4 細(xì)胞移植 常規(guī)胰酶消化各組hUCB－MSCs，并用含胎牛血清的培養(yǎng)液終止，制成單細(xì)胞懸液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法在顯微鏡下(×100)進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整活細(xì)胞濃度為5×1011L－1備用。AD模型大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頭部備皮，體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒手術(shù)區(qū)皮膚，無菌操作，切開皮膚，鈍性分離，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，選取雙側(cè)海馬為移植區(qū)，進(jìn)行移植。一側(cè)移植用細(xì)胞量為 4 μl(2 ×105個(gè)細(xì)胞)，注射速度為 1 μl/min，留針5 min。在對(duì)照組大鼠海馬腦區(qū)注入等量的生理鹽水。局部消毒，縫合皮膚。

1.5 主要觀察指標(biāo) 分別在細(xì)胞移植前1 d和手術(shù)后8 w測(cè)定各組動(dòng)物行為學(xué)，以學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)?yōu)榭陀^觀測(cè)指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多樣本均數(shù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 人hUCB－MSCs定向誘導(dǎo)分化為ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元鏡下觀察 hUCB－MSCs組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變(圖1);分化組hUCBMSCs經(jīng)誘導(dǎo)可向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化(圖2)，低氧分化組hUCB－MSCs轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣形態(tài)的明顯多于常氧分化組。細(xì)胞鑒定:結(jié)果顯示，hUCB－MSCs組未見ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元;分化組可見ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元。通過計(jì)數(shù)得出:常氧分化組ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元約占細(xì)胞總數(shù)的(6.8±0.3)%;低氧分化組ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元約占細(xì)胞總數(shù)的(21.2±4.6)%，兩組相比，差異具有非常顯著性意義(P＜0.01)。

2.2 細(xì)胞移植后各組大鼠的行為學(xué)改變 由表1可知，對(duì)照組AD大鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均下降，與術(shù)前相比，差異無顯著性意義(P＞0.05);hUCB－MSCs移植組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均提高，與移植前相比，差異無顯著性意義(P＞0.05);常氧分化移植組和低氧分化移植組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均提高，后者大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均高于前者，兩者與移植前相比，差異均有顯著性意義(P＜0.01);與對(duì)照組相比，其他3組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均提高(P＜0.01)。

圖1 人hUCB-MSCs(×400)

圖2 神經(jīng)元樣細(xì)胞(×400)

表1 各組大鼠hUCB-MSCs移植前后學(xué)習(xí)記憶成績(jī)變化(±s，n=10)

表1 各組大鼠hUCB-MSCs移植前后學(xué)習(xí)記憶成績(jī)變化(±s，n=10)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與移植前比較:2)P＜0.01

組別 移植前學(xué)習(xí)分?jǐn)?shù) 記憶分?jǐn)?shù)移植8 w后學(xué)習(xí)分?jǐn)?shù) 記憶分?jǐn)?shù)對(duì)照組 40.00±2.04 40.25±2.19 39.00±1.75 39.75±2.19 MSC移植組 40.25±2.99 44.00±2.42 42.50±1.671)45.75±2.371)常氧分化移植組 39.75±2.99 40.25±2.99 45.75±2.901)2)46.00±3.161)2)低氧分化移植組 38.25±2.37 39.75±2.99 52.50±2.041)2)53.00±3.071)2)

3 討論

AD的病因尚不清楚、發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜〔5～10〕，鋁是一種神經(jīng)毒素，易沉積于腦內(nèi)而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用，到目前為止，鋁對(duì)學(xué)習(xí)記憶的抑制作用已在多數(shù)動(dòng)物和人身上得到證實(shí)〔11〕。國(guó)外有學(xué)者報(bào)道鋁作業(yè)工人的短期記憶能力、學(xué)習(xí)能力、視空間感知能力、心理運(yùn)動(dòng)能力均受到一定程度的損害。也有調(diào)查顯示鋁廠附近的兒童其智力要明顯低于同年齡的其他兒童。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給貓、家兔、大鼠和小鼠等染鋁，均可引起一系列行為異常，而且動(dòng)物出現(xiàn)認(rèn)知和記憶障礙的時(shí)間也早于其他指標(biāo)〔6〕。D－半乳糖可致大鼠亞急性衰老，氫溴酸東莨菪堿是中樞膽堿能抑制劑，引起膽堿能系統(tǒng)功能障礙。因此復(fù)合型AD大鼠模型 (集衰老、膽堿能損害、鋁中毒為一體的AD模型)可以更好的模擬出AD患者的病理生理及行為學(xué)表現(xiàn)〔12〕。本實(shí)驗(yàn)制作大鼠模型適合于治療方法的篩選和療效評(píng)價(jià)，可為臨床應(yīng)用hUCB－MSCs治療AD提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和應(yīng)用性。

用于神經(jīng)移植理想的細(xì)胞來源應(yīng)具備:①移植的細(xì)胞在體外可大量繁殖和擴(kuò)增。②安全可靠。③移植細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。④不需要長(zhǎng)時(shí)期使用免疫抑制劑。間充質(zhì)干細(xì)胞具備這些特性，決定了它可以作為移植治療AD的理想細(xì)胞來源。

除此之外，間充質(zhì)干細(xì)胞還具備以下優(yōu)勢(shì):①取材方便，細(xì)胞來源比較充足。除臍血外，骨髓、臍帶等組織也存在間充質(zhì)干細(xì)胞。②在一定培養(yǎng)條件下，可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增。③易被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以及作為基因載體能長(zhǎng)期表達(dá)外源性基因。④能透過血腦屏障，通過靜脈內(nèi)移植。⑤避免了倫理道德上的爭(zhēng)議。⑥具有免疫耐受性或免疫無反應(yīng)性。胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞已用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病〔13，14〕，但無法在臨床上推廣應(yīng)用，由于存在難以克服的困難，主要限制因素是存在倫理道德問題和取材非常困難，所以，尋找新的細(xì)胞來源成為細(xì)胞治療首要解決的問題。最近，已有應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療AD的報(bào)到〔15，16〕，但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)僅限于自體移植方面，在異體移植免疫反應(yīng)問題上有待進(jìn)一步探索。而 hUCB－MSCs免疫源性相對(duì)較低，可以從冷凍保存長(zhǎng)達(dá)0.5～5年的臍血中培養(yǎng)成功，這意味著臍血MSC有著其他來源的MSC所不具備的優(yōu)勢(shì)，將成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病移植治療理想的種子細(xì)胞，有著廣泛的臨床應(yīng)用前景。

hUCB－MSCs作為有潛力的治療手段來預(yù)防各種不同的神經(jīng)組織退化病包括AD正在研究〔17〕，Lee等〔18〕在體外進(jìn)行了在二乙基溴乙酰胺消失過程中培養(yǎng)β淀粉樣蛋白治療的海馬趾神經(jīng)元聚集體來研究hUCB－MSCs治療潛能。證實(shí)了hUCBMSCs共培養(yǎng)通過β淀粉樣蛋白治療減少了海馬趾的凋亡效應(yīng)。而且，在一個(gè)嚴(yán)重的AD鼠模型中在AD相關(guān)的認(rèn)知能力和神經(jīng)病理學(xué)結(jié)果方面來直接實(shí)驗(yàn)hUCB－MSCs的治療效能，證明了神經(jīng)膠質(zhì)活化的標(biāo)志、氧化應(yīng)激和凋亡水平在AD鼠腦中都減少了。有趣的是，hUCB－MSCs治療了AD鼠，證明挽救了包括學(xué)習(xí)功能的恢復(fù)的認(rèn)知能力。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示hUCB－MSCs移植對(duì)癡呆大鼠的認(rèn)知功能障礙有一定的治療作用，且定向誘導(dǎo)分化的hUCB－MSCs移植治療優(yōu)于未分化的hUCB－MSCs，低氧誘導(dǎo)分化的 hUCB－MSCs移植治療效果最佳。hUCB－MSCs的治療作用究竟是通過何種機(jī)制得以實(shí)現(xiàn)，將在以后的研究中進(jìn)一步明確。

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