黃新武 李 華 李國春 熊玉霞 張 紅 秦大蓮 (瀘州醫(yī)學院藥學院藥理教研室，四川 瀘州 646000)

血管性癡呆(VD)不僅嚴重損害患者的健康，影響患者的生命質量，也給家庭和社會帶來沉重負擔，因此，積極探尋防治VD的有效途徑具有重要醫(yī)學價值和社會意義。有研究表明〔1〕，腦內(nèi)具有獨立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，其在VD發(fā)病中起重要作用?？ㄍ衅绽亲畛Ｓ玫囊环N血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)，可直接抑制ACE的活性，減少AngⅡ的生成;氯沙坦屬血管緊張素1型受體(AT1受體)阻滯藥，通過阻滯AT1受體對抗AngⅡ的作用。本研究復制大鼠VD模型，通過Morris水迷宮法觀察卡托普利和氯沙坦對VD模型大鼠學習記憶能力有良好改善的作用〔2〕，本文對模型大鼠海馬細胞凋亡及Bcl-2及Bax蛋白表達的影響進行研究，探討其改善VD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，月齡＞24個月，體重(320±20)g。瀘州醫(yī)學院實驗動物科提供，為一級合格動物。

1.2 材料 卡托普利由汕頭金石制藥總廠生產(chǎn)，批號080505;氯沙坦鉀膠囊，由北京萬生藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，批號:20080903。凋亡TUNEL試劑盒購自美國ROSS公司，兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、SABC、DAB染色試劑盒、蘇木素均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 VD大鼠模型制備及分組 隨機取40只大鼠，采用不同時點分別結扎左、右頸總動脈制備VD模型〔3〕。術后4 w通過Morris水迷宮對制模大鼠進行學習記憶能力的測定，篩選出學習記憶能力明顯障礙，制模不合格10只剔除，模型制備成功30只大鼠，并隨機分為3組，每組10只。根據(jù)藥品說明書常用量體重計算給藥劑量，卡托普利組，卡托普利予2.5 mg/kg，灌胃，1次/d，持續(xù)4 w;氯沙坦組:氯沙坦予2.0 mg/kg，灌胃，1次/d，持續(xù)4 w;模型組:等量生理鹽水灌胃;假手術組10只，雙側頸總動脈不結扎，余同模型大鼠，予等量生理鹽水灌胃。

1.4 組織標本處理 學習記憶能力的測定后將動物給予4%多聚甲醛灌注30 min。斷頭取腦放入4% 多聚甲醛固定，依次酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。

1.5 免疫組織化學法檢測Bcl-2、Bax的表達 參照Bcl-2、Bax試劑盒說明，按常規(guī)SABC法進行，DAB顯色，蘇木素復染。

1.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 參照TUNEL試劑盒說明進行。

1.7 結果觀察 在顯微鏡下觀察每張切片TUNEL陽性細胞、Bcl-2、Bax免疫陽性細胞的表達情況，分析指標運用GD-10.0多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)進行測定，以灰度計算所選視野陽性染色的單位面積(陽性細胞的面積占所選整個視野面積的百分比)，每張切片取梗死灶邊緣區(qū)互不重疊的5個視野，其均值即為該標本每個高倍鏡視野中陽性細胞的單位面積。

1.8 病理檢查 大腦中部冠狀切取3 mm大腦厚片，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切4 μm切片，HE染色。

2 結果

2.1 海馬神經(jīng)元凋亡情況 顯微鏡下觀察，TUNEL染色陽性凋亡神經(jīng)元的細胞核呈棕黃色，神經(jīng)元體積縮小，呈三角形或扇形，尼氏小體消失，核固縮深染，核內(nèi)染色質濃聚，染色質濃集于核周，呈新月形、環(huán)形、長條形、塊狀小體甚至形成核碎片。而陰性神經(jīng)元的胞核則不顯示黃色，神經(jīng)元形態(tài)正常。假手術組大鼠海馬組織中只有零星的凋亡神經(jīng)元;而模型組大鼠可見大量凋亡神經(jīng)元，呈成簇出現(xiàn)，與假手術組比較有顯著意義(P＜0.05)?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠凋亡神經(jīng)元均明顯減少，與模型組比較有顯著意義(P＜0.05)。見表1，圖1。

2.2 海馬Bcl-2和Bax蛋白的表達情況 顯微鏡下觀察，各組大鼠海馬Bcl-2、Bax陽性神經(jīng)元染色均以胞漿有棕黃色物質沉積為主，也有部分胞膜及核膜著色，并可顯示神經(jīng)元輪廓。Bcl-2陽性神經(jīng)元變性較輕，形態(tài)接近正常，胞體不腫脹，基本上呈橢圓形，邊緣較光滑。而Bax陽性神經(jīng)元變性較重，胞體形狀不規(guī)則，邊緣欠光滑。假手術組大鼠海馬Bcl-2、Bax均呈少量表達。模型組大鼠Bcl-2及Bax蛋白表達均明顯增加，與假手術組比較有顯著意義(P＜0.05)?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠Bcl-2及Bax蛋白表達有明顯改善。見表1，圖2，圖3。

2.3 病理形態(tài)學 圖4可見HE染色后神經(jīng)細胞質淡紅色，核呈藍褐色。假手術組大鼠海馬神經(jīng)元排列整齊、密集，細胞完整、結構正常，胞質豐富;細胞核呈圓形、橢圓形，無變性，無固縮及溶解現(xiàn)象。模型組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，排列紊亂，變性明顯，體積縮小，胞核與胞質界限不清，核固縮成三角形或不規(guī)則形?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠海馬缺血壞死較模型組大鼠明顯減輕。

表1 海馬神經(jīng)元凋亡及蛋白表達情況(%，±s，n=10)

表1 海馬神經(jīng)元凋亡及蛋白表達情況(%，±s，n=10)

與假手術組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 細胞凋亡 Bcl-2蛋白表達 Bax 蛋白表達假手術組 4.38±1.342) 5.21±1.142) 3.61±1.552)卡托普利組 11.34±2.142) 23.41±2.171) 9.47±3.112)氯沙坦組 15.22±2.412) 21.53±2.731) 11.26±2.562)模型組 39.24±5.471) 20.08±3.171) 28.93±3.681)

圖1 各組海馬神經(jīng)元凋亡情況(×200)

圖2 海馬Bcl-2蛋白表達(DAB，×200)

圖3 海馬Bax蛋白表達情況(DAB，×200)

圖4 各組大鼠海馬病理形態(tài)學變化(HE，×100)

3 討論

細胞凋亡與許多疾病的發(fā)生有密切關系。細胞凋亡機制在VD研究中受到越來越重視。腦神經(jīng)元對凋亡損傷極其敏感，在腦缺血的病理過程中存在細胞凋亡這一病理機制?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，細胞凋亡的直接原因可能是凋亡細胞內(nèi)基因表達的結果。其中 Bcl-2蛋白家族成員起著至關重要作用〔4〕。Bcl-2和Bax是其家族中調(diào)控細胞凋亡的兩個主要基因，Bcl-2從人淋巴細胞分離出來的具有阻抑細胞凋亡的1個原癌基因，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為1種有效的抑制神經(jīng)元凋亡和壞死的因子，可促進神經(jīng)元的存活以及突觸的再生〔5〕。Bax蛋白是細胞凋亡的激動劑〔6〕。Bax蛋白可自身形成同源二聚體，并易與Bcl-2蛋白形成異源二聚體復合物，Bcl-2表達相對增多時Bcl-2/bax二聚體增多，消除Bax的促凋亡效應，而Bax表達相對增多時Bax/Bax二聚體增加，促凋亡作用上升。因此，一旦Bax蛋白大量表達時，細胞便走向死亡。研究結果顯示，VD模型組大鼠海馬可見大量成簇凋亡神經(jīng)元。模型組大鼠Bcl-2及Bax蛋白表達均增加，但Bax蛋白表達似乎更明顯?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠凋亡神經(jīng)元均明顯減少，Bcl-2及Bax蛋白表達也有明顯改善。

病理檢查結果也顯示，VD模型組大鼠的海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，缺血壞死明顯?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠海馬缺血壞死明顯減輕。海馬是與認知功能相關的重要腦區(qū)，是學習、記憶的高級中樞，它直接參與信息的貯存和處理。由于海馬神經(jīng)元的存活數(shù)量直接影響神經(jīng)元突觸的可塑性效應，從而影響海馬對信息的處理和傳遞。因此，卡托普利和氯沙坦能減輕海馬神經(jīng)元大量凋亡丟失，可能是改善患者腦缺血后引起VD學習記憶障礙的重要機制之一。

1 Ciobica A，Bild W，Hritcu L，et al.Brain renin-angiotensin system in cognitive function:pre-clinical findings and implications for prevention and treatment of dementia〔J〕.Acta Neurol Belg，2009;109(3):171-6.

2 黃新武，李 華，秦大蓮，等.卡托普利和氯沙坦對血管性癡呆模型大鼠學習記憶的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2010;12(6):497-8.

3 黃新武，李 華，秦大蓮，等.不同時點分別結扎左、右頸總動脈建立大鼠血管性癡呆模型〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(14):2006-07.

4 Tsukahara S，Yamamoto S，Tin-Tin-Win-Shwe，et al.Inhalation of low-level formaldehyde increases the bcl-2/Bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice〔J〕.Neuroimmunomodulation，2006;13(2):63-8.

5 Wada A，Yokoo H，Yanagita T，et al.Lithium:potential therapeutics against acute brain injuries and chronic neurodegenerative diseases〔J〕.J Pharmacol Sci，2005;99(4):307-21.

6 Adams JM，Huang DC，Strasser A，et al.Subversion of the bcl-2 life/death switch in cancer development and therapy〔J〕.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2005;70:469-77.