程書珍 王麗君 劉 恒 王曉梅 劉愛(ài)民 駱朋好 (河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 05600)

Tomimoto等〔1〕研究表明，癡呆的首發(fā)癥狀是記憶障礙，中樞膽堿功能損傷對(duì)記憶功能的影響有重要意義。在對(duì)阿爾茨海默病(AD)的諸多研究中，膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變的發(fā)病機(jī)制已被多數(shù)學(xué)者接受，但鋁對(duì)AD模型大鼠膽堿能系統(tǒng)的影響報(bào)道較少。鑒于此，采用鋁飼料喂飼大鼠制備AD動(dòng)物模型，觀察了鋁攝入對(duì)大鼠海馬組織中乙酰膽堿酯酶(AchE)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性及乙酰膽堿(Ach)含量的影響，并研究了通經(jīng)補(bǔ)腎中藥復(fù)方對(duì)AD模型大鼠海馬膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 AlC13·6H2O，分析純，天津雙船化學(xué)試劑廠;ChAT和AChE測(cè)定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。大鼠乙酰膽堿ELISA試劑盒(美國(guó)Sigma);中藥復(fù)方(通經(jīng)補(bǔ)腎復(fù)方)由淫羊藿、熟地、黃芪、水蛭等組成，由河北省石家莊醫(yī)藥公司提供，生藥經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定均為純品。中藥經(jīng)浸泡、文火煎熬，每毫升生藥含量為2.7 g，4℃冰箱保存，用前進(jìn)行巴氏消毒。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)，分析純。UV－250型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)。電子天平(上海精天電子儀器有限公司產(chǎn)品)，TGL－16G臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科技儀器廠)。

1.2 動(dòng)物分組與處理 選用北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得的體重(350±20)g健康清潔級(jí)3月齡 SD大鼠84只(合格證號(hào)SCXK－00－0004)。采用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，按體重隨機(jī)分為7組，每組12只，其中對(duì)照組喂普通飼養(yǎng)，模型組及3個(gè)中藥組在普通飼料的基礎(chǔ)上，按體重8%的進(jìn)食量添加A1C13·6H2O，劑量分別為:11.2、55.9、111.9 mg/kg 體重，喂飼鋁飼料當(dāng)天起，3個(gè)中藥組用中藥煎劑灌胃，劑量分別為:10.8、21.6，30.4 g·kg－1·d－1，各模型組、對(duì)照組大鼠每天灌服等量溫開水。動(dòng)物自由飲水，動(dòng)物房溫度(20±2)℃。

1.3 ChAT及AchE的活性、Ach的水平測(cè)定 上述實(shí)驗(yàn)到第90天時(shí)，大鼠禁食24 h，斷頭處死，快速取出全腦，置于冰盒上，分離海馬并稱重。按照重量和體積比1∶10的比例，加入生理鹽水冰浴勻漿，4℃離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，立即測(cè)定。紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定海馬ChAT、AchE活性，其中蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，所有操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。最后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度，計(jì)算ChAT及AchE的活性。雙抗體夾心法ELISA法測(cè)定海馬Ach的水平。用純化的大鼠ACh抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入ACh再與HRP標(biāo)記的ACh抗體結(jié)合，形成抗體－抗原－酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠Ach含量呈正比。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中ACh濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各劑量鋁飼料組大鼠海馬ChAT、AchE的活性及Ach的水平 見(jiàn)表1，與對(duì)照組比較，中、高劑量鋁飼料組大鼠海馬中AchE的活性明顯增高(P＜0.01)，ChAT活性明顯降低(P＜0.01)，Ach含量顯著減少(P＜0.01)。低劑量鋁飼料組與對(duì)照組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 各中藥組大鼠海馬ChAT、AchE的活性及Ach的水平

見(jiàn)表1，與高劑量鋁飼料組比較，中、高劑量中藥組大鼠海馬中AchE活性顯著降低(P＜0.01)，ChAT活性顯著升高(P＜0.01)，Ach含量明顯增加(P＜0.01)。低劑量中藥組與高劑量鋁飼料組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但有改善趨勢(shì)。

表1 各組大鼠海馬ChAT、AchE的活性及Ach的水平(±s，n=12)

表1 各組大鼠海馬ChAT、AchE的活性及Ach的水平(±s，n=12)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與高劑量鋁飼料組比較:2)P＜0.01

組別 AchE(U/mg) ChAT(U/mg) Ach(μg/ml)對(duì)照組1.41±0.18 312.15±36.21 22.35±7.23低劑量鋁飼料組 1.51±0.06 285.34±38.25 17.62±2.87中劑量鋁飼料組 1.81±0.131) 240.54±15.321) 13.92±5.211)高劑量鋁飼料組 1.88±0.161) 221.13±17.461) 12.86±4.351)低劑量中藥組 1.79±0.21 229.01±11.25 13.94±3.89中劑量中藥組 1.48±0.152) 276.57±16.312) 18.16±1.252)高劑量中藥組 1.42±0.272) 280.21±18.632) 21.31±1.682)

3 討論

AD病因及發(fā)病機(jī)制主要有微量元素學(xué)說(shuō)、膽堿能遞質(zhì)途徑異常學(xué)說(shuō)、淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)、基因突變學(xué)說(shuō)、鈣代謝紊亂學(xué)說(shuō)、自由基損傷學(xué)說(shuō)、雌激素缺乏學(xué)說(shuō)等。研究表明，鋁與AD關(guān)系密切，過(guò)量接觸與體內(nèi)蓄積可能是AD的病因之一〔2〕。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制是多方面的，其中中樞膽堿能系統(tǒng)是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的主要通路，與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切，其核心是Ach，是促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有興奮和抑制雙重作用，以興奮為主，參與大腦皮層的喚醒、情緒和運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)等功能的調(diào)節(jié)，特別是對(duì)學(xué)習(xí)和認(rèn)知等方面被認(rèn)為是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一〔3〕。Ach廣泛分布在腦內(nèi)，由膽堿、乙酰輔酶A在ChAT的催化下合成，并由AchE分解，ChAT和AchE共同作用維持Ach含量的動(dòng)態(tài)平衡，二者的活性反映了Ach在腦中的合成和代謝速率。AD患者腦內(nèi)ChAT活性下降被認(rèn)為是AD的一個(gè)標(biāo)志性生化特征。Lopez等〔4，5〕多個(gè)研究報(bào)道顯示，老年性癡呆患者Ach合成減少，ChAT的活性下降，且與癡呆的嚴(yán)重程密切相關(guān)。AchE作為膽堿能纖維的標(biāo)志，其活性增高，Ach分解加速，影響學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力〔6，7〕。本結(jié)果顯示，鋁的過(guò)多攝入使大鼠海馬Ach減少可能是AD發(fā)病的機(jī)制之一。

AD多屬于脾腎虧損、脾虛痰阻，常表現(xiàn)為面色晄白，氣短乏力，可兼有頭暈眼花、腰膝酸痛、心悸等癥，表明體內(nèi)氣血不足，陰虛陽(yáng)弱。淫羊藿，性辛、甘、溫，溫腎陽(yáng)，有補(bǔ)腎強(qiáng)陽(yáng)、調(diào)節(jié)免疫和分泌系統(tǒng)、改善機(jī)體代謝和各器官功能;黃芪味甘，氣微溫，具有補(bǔ)肺益氣固表，補(bǔ)氣補(bǔ)血，能補(bǔ)五臟諸虛;熟地，味甘，微溫質(zhì)潤(rùn)，既補(bǔ)血滋陰，又能補(bǔ)精益髓，通血脈，益氣力。水蛭，活血逐瘀，通經(jīng)，具有減輕腦組織炎癥反應(yīng)，改善局部血流循環(huán)，保護(hù)腦組織免遭壞死及促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)等功效。根據(jù)扶正固本、通經(jīng)補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)血的治則，由上述組分為主配方組成通經(jīng)補(bǔ)腎復(fù)方防治鋁誘導(dǎo)的AD大鼠，本結(jié)果表明該復(fù)方能明顯提高大鼠海馬中ChAT活性，抑制AchE活性，增加Ach的合成，顯著改善AD大鼠膽堿能系統(tǒng)功能，證明復(fù)方對(duì)海馬組織有一定的保護(hù)作用，為臨床治療AD提供了理論依據(jù)。

1 Tomimoto H，Ohtani R，Shibata M，et al.Loss of cholinergic pathways in vascular dementia of the Binswanger type〔J〕.Dement Geriatr Cogn Disord，2005;19(5－6):282－8.

2 Gonda Z，Lehotzdy K，Midlsi A.Neurotoxicity induced by prenatal aluminum exposure in rats〔J〕.Neurotoxicology，1996;17(2):459.

3 索國(guó)玲，洪 麗，王秀利.丹參對(duì)幼年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)學(xué)習(xí)記憶及海馬ChAT、AChE活性的影響〔J〕.東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007;26(4):271－4.

4 Lopez OL，Hamilton RL，Becker JT，et al.Severity of cognitive payments and the clinical diagnosis of AD with Lewy〔J〕.Bodies Neurology，2000;54(9):1780－7.

5 Zhong CB，Xu XH，Wang XL.Advance in research on cholinergic theory of Alzheimer′s disease〔J〕.Chin Pharmacol Bull，2003;19(7):727－31.

6 Bartolucci C，Siotto M，Ghidini E，et al.Structural determinants of Tor－pedo Californian acetyl cholinesterase inhibition by the novel and orally active carbonate based anti－Alzheimer drug ganstigmine(CHF－2819)〔J〕.J Med Chem，2006;49(17):5051－8.

7 Gil－Bea FJ，García－Alloza M，Domínguez J，et al.Evaluation of cholinergic markers in Alzheimer′s disease and in a model of cholinergic deficit〔J〕.Neurosci Lett，2005;375(1):37.