孔渝菡 秦新月 郭振委

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

腦缺血后處理(IPC)即在腦缺血后再灌注(I/R)初期通過各種物理或藥物方式實(shí)施的一種干預(yù)手段，是近年來發(fā)現(xiàn)的能減少缺血性腦損傷的方法，但其最佳實(shí)施策略及具體保護(hù)機(jī)制仍存在爭(zhēng)議〔1〕。本研究擬探討對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)/再灌注大鼠實(shí)施不同方式的IPC對(duì)其梗死體積的影響，同時(shí)觀察海馬排斥導(dǎo)向分子a(RGMa)這一神經(jīng)再生中的排斥性導(dǎo)向分子在幾種缺血后處理中的表達(dá)，以尋找最有效的IPC方法及推測(cè)其可能機(jī)制。對(duì)于臨床上缺血性腦血管疾病的防治具有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年(12周齡)SD大鼠，雌雄各半共90只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(渝)2007－0001。成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、大腦中動(dòng)脈IR模型組、IPC－S組(頸總動(dòng)脈10 s×6次循環(huán))、IPC－M組(頸總動(dòng)脈5 min×3次循環(huán))、遠(yuǎn)隔缺血后處理(RIPC)組、延遲后處理(DIPC)組。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)有關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器 2，3，5－三苯基氯化四唑(TTC)(美國(guó)Amresco公司)、兔多克隆抗RGMa抗體(英國(guó)Abcam公司)、免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、RNA提取液Trizol、RT－PCR反應(yīng)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC)(美國(guó)Sigma公司)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)引物合成(重慶升博生物技術(shù)公司)、PCR預(yù)混酶(天根生化科技有限公司)、凝膠掃描成像系統(tǒng) ChemiDoc xRS(美國(guó) Bio－Rad公司)、梯度 PCR儀(美國(guó) Bio－Rad 公司)。

1.3 腦梗死模型及缺血后處理實(shí)施方案 大鼠用3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，根據(jù)Longa等〔2〕方法制作線栓法大腦I/R模型。IPC－S組:同時(shí)阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流10 s，恢復(fù)血流10 s，如此進(jìn)行6次缺血/再灌注循環(huán)過程;IPCM組:雙頸總動(dòng)脈5 min×3次循環(huán);RIPC組:右股動(dòng)脈5 min×3次循環(huán);DIPC組:缺血24 h后雙頸總動(dòng)脈5 min×3次循環(huán)。1.4 腦梗死體積測(cè)定 大鼠I/R 48 h后，腹腔注射3.5%水合氯醛深度麻醉并處死取腦。在大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域前后做2 mm厚連續(xù)冠狀切片5片，腦片置于2%TTC溶液中于37℃水箱避光孵育30 min，用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS)沖洗2～3次，4%多聚甲醛緩沖液(PFA)固定。數(shù)碼相機(jī)拍照后使用Image－Pro Plus(IPP)6.0分析軟件 (美國(guó) Media Cybernetics公司)計(jì)算腦梗死容積。

1.5 RT－PCR檢測(cè)不同 IPC組 RGMa mRNA表達(dá) 從 Gene Bank中找出RGMa和β－actin的基因序列，設(shè)計(jì)上、下游引物分別 為 5′－GCTGGATGGATGGGTATGGG－3′和 5′－GCCGCAGTGAGTGTAGTTGG－3′擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 456 bp。β－actin 為內(nèi)參對(duì)照其上、下游引物分別為 5′CGTAAAGACCTCTATGCCAACA－3′和 5′－CGGACTCATCGTACTCCTGCT－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 229 bp。取各組缺血側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)皮質(zhì)及海馬于液氮中保存。Trizol法提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl在2%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像儀下觀察并照相。用Quantity One(美國(guó)Bio－Rad公司)分析，以擴(kuò)增后RGMa與β－actin電泳條帶平均光密度比值表示RGMa mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)RGMa蛋白表達(dá) 大鼠過度麻醉后經(jīng)心臟灌注PBS 200 ml和4%PFA 400 ml后立即斷頭取腦，放入4%PFA中固定，24 h后石蠟包埋，制作4 μm石蠟切片用作免疫組織化學(xué)觀察。在顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞并拍照，用IPP 6.0分析軟件測(cè)量分析其光密度值。

2 結(jié)果

2.1 不同IPC對(duì)腦梗死體積的影響 假手術(shù)組腦片呈深紅色，無缺血區(qū)，再灌注后的其他組均可見明顯的呈白色不規(guī)則的梗死灶，I/R梗死體積百分比明顯升高(P＜0.01)。與I/R組比較，IPC－S組梗死體積百分比明顯降低(P＜0.01)，RIPC與IPC－M組也有不同程度降低(P＜0.05)，DIPC組梗死面積減少不明顯。見表1，圖1。

表1 各組大鼠腦梗死體積、缺血側(cè)及不同缺血后處理RGMa mRNA及蛋白表達(dá)比較(±s，n=15)

表1 各組大鼠腦梗死體積、缺血側(cè)及不同缺血后處理RGMa mRNA及蛋白表達(dá)比較(±s，n=15)

與假手術(shù)組相比:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與I/R組相比:3)P＜0.01，4)P＜0.05

組別 假手術(shù)組 I/R組 IPC－S組 RIPC組 DIPC組 IPC－M組梗死體積(%) 0.00±0.00 33.14±6.151) 16.38±3.681)3) 25.64±4.911)3) 30.60±4.151) 26.82±4.291)4)皮質(zhì) 0.31±0.06 0.70±0.171) 0.44±0.101)3) 0.51±0.101)4) 0.62±0.061) 0.53±0.121)4)海馬 0.34±0.05 0.63±0.041) 0.43±0.062)3) 0.51±0.081)3) 0.58±0.071) 0.53±0.031)3)

圖1 TTC染色檢測(cè)腦梗死體積

2.2 不同IPC對(duì)大鼠缺血側(cè)RGMa mRNA表達(dá)的影響 見表1，圖2，圖3。與假手術(shù)組相比，缺血MCAO/再灌注48 h后模型組和缺血IPC各組缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa mRNA的表達(dá)明顯增高(P＜0.01);各IPC組與MCAO/再灌注組比較顯示，除延遲后處理組外，各缺血后處理后缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa mRNA的表達(dá)均有不同程度減少(P＜0.01或P＜0.05)。

圖2 大鼠缺血皮質(zhì)部位RGMa mRNA表達(dá)

圖3 大鼠缺血海馬部位RGMa mRNA表達(dá)

2.3 不同方式缺血處理對(duì)大鼠缺血側(cè)RGMa蛋白表達(dá)的影響在假手術(shù)組，皮質(zhì)及海馬區(qū)域可見少量RGMa蛋白陽性表達(dá)，而缺血MCAO/再灌注后48 h時(shí)，在缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬均可見RGMa蛋白陽性表達(dá)明顯增高，與假手術(shù)組相比較有顯著性差異(P＜0.01);在給予IPC之后，RGMa蛋白的陽性表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)，但是仍未恢復(fù)到缺血前水平(P＜0.01)。見表 2，圖 4。

表2 各組大鼠缺血側(cè)RGMa蛋白表達(dá)(±s，n=15)

表2 各組大鼠缺血側(cè)RGMa蛋白表達(dá)(±s，n=15)

組別 假手術(shù)組 IR IPC－S組 RIPC組 DIPC組 IPC－M組皮質(zhì) 0.34±0.08 0.77±0.081) 0.57±0.071)3) 0.67±0.041)3) 0.73±0.041) 0.69±0.041)2)海馬 0.30±0.05 0.73±0.051) 0.55±0.041)3) 0.60±0.071)3) 0.70±0.041) 0.67±0.041)2)

與假手術(shù)組相比:1)P＜0.01;與I/R組相比:2)P＜0.01;與I/R組相比:3)P＜0.05

圖4 不同缺血后處理后缺血側(cè)RGMa表達(dá)(×200)

3 討論

早期意義上的IPC是偶然發(fā)現(xiàn)的幾例心肌梗死的病人中，由于短暫的逐漸恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血供減少了后來發(fā)生的心房纖顫，研究人員逐漸開始關(guān)注這種方式的心臟保護(hù)作用〔3〕。相比缺血預(yù)處理在外科范圍的應(yīng)用，IPC具有更廣泛的臨床上的可觀察、可操控性。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩種不同時(shí)間的近端IPC，一種肢體遠(yuǎn)隔后處理及一種延遲后處理方式，意義在于它們均可臨床中通過按、捆壓的方式實(shí)現(xiàn)，同時(shí)本文觀察了這幾種缺血后處理方式能夠?qū)崿F(xiàn)的腦保護(hù)效果。

本研究發(fā)現(xiàn)在再灌注初期進(jìn)行的夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈持續(xù)數(shù)秒至數(shù)分鐘的幾個(gè)循環(huán)均能起到減少腦梗死體積的作用，并且再灌注初期進(jìn)行下肢的遠(yuǎn)隔后處理每個(gè)循環(huán)數(shù)分鐘也能起到類似的效果。然而再灌注24 h后進(jìn)行的IPC卻未能達(dá)到腦保護(hù)作用，這說明IPC存在治療時(shí)間窗的問題。Burda等〔4〕報(bào)道在腦缺血48 h后進(jìn)行后處理發(fā)現(xiàn)能減少腦損傷，于是提出IPC的延遲治療時(shí)間在48 h內(nèi)，但其所用的動(dòng)物模型是全腦缺血模型，和本研究觀察的局灶性缺血模型不一致。而Ren等〔5〕研究使用MCAO在缺血3、6、12 h后進(jìn)行后處理，發(fā)現(xiàn)6 h內(nèi)進(jìn)行后處理均有不同程度的腦保護(hù)效果，未有進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的嘗試。Pignataro等〔6〕在體外實(shí)驗(yàn)也嘗試皮質(zhì)神經(jīng)元糖氧剝奪后10、30或60 min后處理只有10 min組具有神經(jīng)保護(hù)作用，提出后處理的起始時(shí)間和處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)結(jié)果有重要影響。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論基本一致。說明局灶性缺血模型的后處理治療時(shí)間窗還有待確定，至少并沒有全腦缺血模型中提到的那么樂觀。目前公認(rèn)的還是只有早期的后處理才能達(dá)到理想的效果。

目前已知的可能參與IPC器官保護(hù)的機(jī)制包括減少自由基產(chǎn)生、改善內(nèi)皮功能、保護(hù)血腦屏障的完整、減少炎癥、抑制凋亡通路以及減少活性氧(ROS)相關(guān)分子的激活〔1，6，7〕，RGMa 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種軸突導(dǎo)向分子，它與其受體Neogenin結(jié)合后導(dǎo)致生長(zhǎng)錐塌陷，抑制軸突再生〔8～10〕。本研究提示RGMa在缺血的過程中被激活而可能參與IR損傷后神經(jīng)損傷及修復(fù)，而IPC－S組神經(jīng)損傷最少。結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，本研究認(rèn)為IPC采用早期、短時(shí)程的多次循環(huán)是最佳策略，且方式可以是近端阻斷頸總動(dòng)脈及遠(yuǎn)端阻斷肢體大動(dòng)脈血流等多種方式，其中在離缺血灶更近的血管實(shí)施可取得更好療效。IPC腦保護(hù)的分子機(jī)制可能與抑制RGMa及其受體結(jié)合，減少軸突損傷有關(guān)。

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