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        姜黃素對(duì)放線菌素D/TNF-α誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響

        2012-07-31 14:06:34行妍妍汪軍兵陸大祥唐紅梅鄧欽瑩熊?chē)?guó)吟
        中國(guó)病理生理雜志 2012年10期
        關(guān)鍵詞:腦片姜黃孵育

        行妍妍,汪軍兵,謝 賽,龔 正,陸大祥,董 軍△,唐紅梅,潘 銳,鄧欽瑩,熊?chē)?guó)吟

        (1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2暨南大學(xué)-香港大學(xué)腦功能與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科,廣東 廣州 510632)

        隨著艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)在全世界的廣泛傳播,人們對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,尤其是HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知紊亂(HIV - associated neurocognitive disorder,HAND)的關(guān)注度逐漸增高。最新研究表明,HIV-1病毒蛋白感染激活巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子引起的腦內(nèi)免疫反應(yīng)是HAND神經(jīng)元損傷的主要原因[1]。腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)就是其中一種重要的細(xì)胞因子,能在組織損傷及炎癥中通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但正常細(xì)胞對(duì)TNF-α并不敏感,除非同時(shí)加用抑制RNA或蛋白質(zhì)合成的藥物,如放線菌素 D(actinomycin D,ActD)才能顯示明顯的毒性作用[2]。

        中藥單體姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物根莖中提取的一種天然活性成分,是一種安全有效的具有抗炎、抗HIV等多種藥理活性的藥物[3],這些藥理活性使其具有了防治HAND的潛力。因此本研究通過(guò)觀察中藥單體姜黃素對(duì)ActD/TNF-α協(xié)同誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響,探討姜黃素對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。

        材料和方法

        1 材料

        高分化PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(36只,雌雄不限)由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;姜黃素(DMSO溶解,超凈水稀釋)購(gòu)自Fluka;TNF-α(超凈水稀釋)購(gòu)自PeproTech;ActD(DMSO稀釋)購(gòu)自Sigma;IX-71型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus;Annexin V-FITC檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司;FACSAria流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD。

        2 方法

        2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng) PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,待單層細(xì)胞70%~80%匯合后,用0.25%胰酶消化后傳代培養(yǎng)。

        2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將PC12細(xì)胞分為以下6組:對(duì)照組(control)、TNF-α組、ActD組、姜黃素組、ActD/TNF-α組和姜黃素+ActD/TNF-α組,調(diào)整藥物終濃度50 μg/L TNF - α、10 μg/L ActD 和5 μmol/L 姜黃素。

        2.3 倒置熒光顯微鏡普通光觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,將細(xì)胞種植于6孔培養(yǎng)板,加藥處理后的細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。最后用Olympus Image-Pro Plus 6.0軟件拍攝細(xì)胞照片并進(jìn)行對(duì)比分析。

        2.4 Annexin V-PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,經(jīng)0.25%胰酶消化后收集,PBS洗滌2次,收集(1~5)×105細(xì)胞,依次加入binding buffer懸浮細(xì)胞 500 μL、Annexin V - FITC 5 μL 和 PI 5 μL,混勻,室溫下避光反應(yīng)10~15 min,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

        2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后,PBS洗1次,加入5 μmol/L鈣離子熒光探針Fluo-3 AM,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后離心去除多余染料,用PBS洗1次,PBS懸浮細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

        2.6 海馬腦片長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)的誘導(dǎo)和記錄

        2.6.1 實(shí)驗(yàn)分組 36只大鼠隨機(jī)分為6組,每組6只。切成腦片后通過(guò)孵育給藥的方式,用50 mL藥液孵育各組腦片0.5 h,各組給藥情況及劑量同PC12細(xì)胞。

        2.6.2 離體海馬腦片的制備 大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后快速斷頭取腦,腦組織放入冰凍的(4℃)通氧人工腦脊液(ACSF)中冰凍2 min,分離海馬并用組織切片機(jī)沿海馬長(zhǎng)軸方向連續(xù)切成400 μm厚的切片,將切好的腦片移入各組預(yù)先經(jīng)氧飽和的ACSF中33℃孵育30 min。

        2.6.3 腦片的孵育 實(shí)驗(yàn)采用靜置-灌流兩用界面式浴槽,浴槽上置有尼龍網(wǎng)。腦片置于網(wǎng)上孵育,下面與槽內(nèi) ACSF接觸。孵育過(guò)程通以含95%O2和5%CO2的混合氧,室溫孵育1 h后轉(zhuǎn)入記錄槽準(zhǔn)備記錄。

        2.6.4 LTP的誘發(fā)及記錄 絕緣的雙極鎢電極作為刺激電極,每隔30 s給予恒定的電流刺激(50~400 μA)Schaffer側(cè)支,刺激的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間以能產(chǎn)生30%~40%最大反應(yīng)為宜,此為基礎(chǔ)刺激。充以ACSF的玻璃微電極(阻抗為2~5 MΩ)作為記錄電極,將記錄電極插入CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突層100~200 μm,記錄的電活動(dòng)是給予電刺激后CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突層的場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP),經(jīng)放大器 (Axon 200B)放大后,通過(guò)數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon Digidata 1322A)在2.5 kHz頻率下數(shù)字化電信號(hào),并貯存在電腦上。給予30 min基礎(chǔ)刺激后,用高頻電刺激(high-frequency stimulation,HFS;頻率100 Hz,持續(xù)1 s,串間隔20 s,共2串)刺激 Schaffer側(cè)支軸突,在海馬CA1區(qū)記錄fEPSP的變化,進(jìn)行60 min記錄。其中,第45 min fEPSP起始斜率的值代表LTP的誘發(fā)和變化情況。如果fEPSP起始斜率增幅在20%以上,并且能維持30 min以上則認(rèn)為L(zhǎng)TP成功誘發(fā)。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)。LTP實(shí)驗(yàn)采用Original 7.0和pClamp 9.0軟件分析,測(cè)量給予腦片HFS后第45 min fEPSP的起始斜率,以基礎(chǔ)水平的百分?jǐn)?shù)形式表示LTP的幅度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 姜黃素對(duì)ActD/TNF-α致細(xì)胞形態(tài)變化的影響

        倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),正常組PC12細(xì)胞體積較大,神經(jīng)突起明顯,細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)。TNF-α組、ActD組和姜黃素組PC12細(xì)胞形態(tài)與正常組無(wú)明顯區(qū)別。ActD/TNF-α組細(xì)胞發(fā)生明顯損傷:體積變小,突起減少變短,細(xì)胞貼壁能力減弱。而姜黃素干預(yù)組細(xì)胞與ActD/TNF-α組細(xì)胞相比,損傷程度明顯改善:突起也有恢復(fù),細(xì)胞貼壁能力增強(qiáng),細(xì)胞數(shù)量也明顯增加,見(jiàn)圖1。

        Figure 1.Effect of curcumin(Cur)on morphological changes of PC12 cells treated with ActD/TNF-α.A:control;B:50 μg/L TNF - α;C:10 μg/L ActD,D:5 μmol/L Cur;E:50 μg/L TNF - α +10 μg/L ActD;F:5 μmol/L Cur+50 μg/L TNF - α +10 μg/L ActD.圖1 姜黃素對(duì)ActD/TNF-α誘導(dǎo)PC12細(xì)胞形態(tài)變化的影響

        2 姜黃素對(duì)ActD/TNF-α致細(xì)胞凋亡的影響

        流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組的凋亡率為4.03% ±0.22%,TNF-α組、ActD組和單獨(dú)姜黃素組的凋亡率與正常對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而ActD/TNF-α處理PC12細(xì)胞后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率達(dá)到38.67% ±2.08%,明顯高于正常對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05);姜黃素干預(yù)后細(xì)胞凋亡率為19.67% ±2.52%,與ActD/TNF-α組相比有顯著差異(P<0.05),說(shuō)明ActD和TNF-α協(xié)同處理可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞明顯凋亡,姜黃素則可以改善這種損傷,見(jiàn)圖2。

        Figure 2.Effect of curcumin(Cur)on the apoptotic rate of PC12 cells damaged by ActD/TNF-α..n=3.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs ActD+TNF-α.圖2 姜黃素對(duì)ActD/TNF-α損傷的PC12細(xì)胞凋亡率的影響

        3 姜黃素對(duì)ActD/TNF-α致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響

        圖3中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示,TNF-α組、ActD組和單獨(dú)姜黃素組PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ActD/TNF-α組細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。經(jīng)5 μmol/L姜黃素干預(yù)后,細(xì)胞Ca2+熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.05)。這說(shuō)明ActD/TNF-α可引起PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高,而姜黃素可抑制由ActD/TNF-α引起的PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高。

        4 姜黃素對(duì)ActD/TNF-α致海馬CA1區(qū)LTP抑制作用的影響

        對(duì)照組給予HFS后,fEPSP起始斜率顯著增大,平均增強(qiáng)幅度為159.52% ±7.46%;TNF-α組、ActD組和單獨(dú)姜黃素組平均增強(qiáng)幅度與正常對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。ActD/TNF-α組給予HFS后fEPSP起始斜率增大不明顯,且很快回到基線水平,平均增強(qiáng)幅度為 116.80% ±7.68%,與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=6)。姜黃素與ActD/TNF-α共孵育海馬腦片予以HFS后,fEPSP起始斜率為136.68% ±6.13%,與ActD/TNF-α組相比顯著增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=6)。表明本實(shí)驗(yàn)條件下,ActD/TNF-α顯著抑制大鼠海馬神經(jīng)元LTP的產(chǎn)生,而姜黃素可改善ActD/TNF-α對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性的抑制作用,對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元有功能性保護(hù)作用,見(jiàn)圖4。

        Figure 3.Effect of curcumin(Cur)on concentrations in Ca2+of PC12 cells exposed to ActD/TNF-α..n=3.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs ActD/TNF-α.圖3 姜黃素對(duì)ActD/TNF-α致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響

        Figure 4.The long-term potentiation in the CA1 region of rat hippocampal slices in different groups.HFS:high-frequency stimulation;fEPSP:field excitatory postsynaptic potential.圖4 各組大鼠海馬腦片CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)

        討 論

        神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是大腦發(fā)育過(guò)程中的一種正常生理過(guò)程,但在大腦損傷和疾病狀態(tài)下,凋亡便成為對(duì)大腦有害的因素,導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)元損傷和丟失[4]。研究表明,當(dāng)機(jī)體處于炎癥等多種病理狀態(tài)時(shí),TNF-α能誘導(dǎo)某些細(xì)胞凋亡,如HAND患者腦內(nèi)TNF-α合成和分泌明顯增加。研究發(fā)現(xiàn),TNF-α需與ActD合用才可引發(fā)明顯的肝細(xì)胞凋亡。ActD為轉(zhuǎn)錄抑制劑,可使肝細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感性大大增強(qiáng)[2]。因此本研究采用TNF-α和ActD連用以探究二者的協(xié)同致凋亡作用。篩選出合適的用藥劑量后,我們采用10 μg/L ActD和50 μg/L TNF-α協(xié)同作用PC12細(xì)胞24 h,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),PC12細(xì)胞突觸明顯縮短、胞體皺縮、細(xì)胞數(shù)量也明顯減少,細(xì)胞發(fā)生了明顯損傷,流式細(xì)胞術(shù)也顯示ActD/TNF-α組凋亡率明顯上升,證實(shí)了ActD/TNF-α可協(xié)同誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡。

        中藥單體姜黃素具有抗炎、抗HIV-1、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理功效,并且具有毒副作用小、血腦屏障透過(guò)性好等優(yōu)點(diǎn),可能是治療HAND的前景藥物。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明姜黃素可改善gp120 V3環(huán)所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠的行為學(xué)功能,促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白的表達(dá)并提高學(xué)習(xí)記憶能力;保護(hù)gp120 V3環(huán)損傷的大鼠海馬神經(jīng)元突觸,保護(hù)神經(jīng)元突觸形態(tài)及其基本功能,抑制神經(jīng)元的凋亡[5-7]。在此基礎(chǔ)之上,本研究擬觀察姜黃素對(duì)ActD/TNF-α誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響并探明其可能機(jī)制。倒置顯微鏡實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)5 μmol/L的姜黃素可以改善ActD/TNF-α對(duì)細(xì)胞的損傷作用;流式細(xì)胞術(shù)顯示姜黃素可以顯著減少ActD/TNF-α引起的細(xì)胞凋亡。由此我們初步得知姜黃素對(duì)ActD/TNF-α協(xié)同誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

        1973年Bliss等[8]通過(guò)高頻電刺激麻醉兔的內(nèi)嗅皮層,興奮海馬表層的穿通纖維,在齒狀回記錄場(chǎng)電位,發(fā)現(xiàn)了LTP效應(yīng)。如今此效應(yīng)被公認(rèn)為神經(jīng)元生理活動(dòng)和信息儲(chǔ)存的客觀指標(biāo),廣泛用于學(xué)習(xí)記憶過(guò)程的機(jī)制及藥物對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響的研究。本實(shí)驗(yàn)中我們采用離體大鼠海馬腦片,運(yùn)用細(xì)胞外微電極記錄技術(shù)觀察ActD/TNF-α對(duì)大鼠海馬腦片CA1區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性的影響。發(fā)現(xiàn)ActD/TNF-α處理后,LTP的誘發(fā)明顯受到抑制,而用姜黃素和ActD/TNF-α共同孵育海馬腦片后,海馬腦片的 LTP部分恢復(fù),fEPSP的起始斜率與ActD/TNF-α組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此進(jìn)一步證實(shí),姜黃素可以部分拮抗ActD/TNF-α造成的大鼠海馬LTP抑制,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的正常功能。

        那么姜黃素究竟是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用的呢?針對(duì)此問(wèn)題,我們進(jìn)行了更近一步的研究。在神經(jīng)系統(tǒng)里,鈣離子是重要的細(xì)胞內(nèi)信使,是維持突觸傳遞、可塑性和神經(jīng)元發(fā)育的重要物質(zhì)[9]?!扳}調(diào)整點(diǎn)”的假說(shuō)認(rèn)為:細(xì)胞內(nèi)適宜濃度的Ca2+可以促使生長(zhǎng)錐的正常生長(zhǎng)、延伸,而Ca2+濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)則會(huì)抑制神經(jīng)突起的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用Fluo-3 AM標(biāo)記技術(shù)測(cè)定胞內(nèi)游離Ca2+的變化,發(fā)現(xiàn)50 μg/L TNF- α 和 10 μg/L ActD 共孵育可以顯著升高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度,而用姜黃素共同孵育后,ActD/TNF-α造成的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的高濃度顯著降低。這個(gè)研究結(jié)果提示,姜黃素發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制可能跟降低PC12細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度、抑制胞內(nèi)發(fā)生鈣超載引起的細(xì)胞不可逆損傷有關(guān)。

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