行妍妍，汪軍兵，謝 賽，龔 正，陸大祥，董 軍△，唐紅梅，潘 銳，鄧欽瑩，熊?chē)?guó)吟

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2暨南大學(xué)－香港大學(xué)腦功能與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510632)

隨著艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)在全世界的廣泛傳播，人們對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，尤其是HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知紊亂(HIV － associated neurocognitive disorder，HAND)的關(guān)注度逐漸增高。最新研究表明，HIV－1病毒蛋白感染激活巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子引起的腦內(nèi)免疫反應(yīng)是HAND神經(jīng)元損傷的主要原因［1］。腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF－α)就是其中一種重要的細(xì)胞因子，能在組織損傷及炎癥中通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但正常細(xì)胞對(duì)TNF－α并不敏感，除非同時(shí)加用抑制RNA或蛋白質(zhì)合成的藥物，如放線菌素 D(actinomycin D，ActD)才能顯示明顯的毒性作用［2］。

中藥單體姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物根莖中提取的一種天然活性成分，是一種安全有效的具有抗炎、抗HIV等多種藥理活性的藥物［3］，這些藥理活性使其具有了防治HAND的潛力。因此本研究通過(guò)觀察中藥單體姜黃素對(duì)ActD/TNF－α協(xié)同誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響，探討姜黃素對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

高分化PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);健康Sprague－Dawley(SD)大鼠(36只，雌雄不限)由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;姜黃素(DMSO溶解，超凈水稀釋)購(gòu)自Fluka;TNF－α(超凈水稀釋)購(gòu)自PeproTech;ActD(DMSO稀釋)購(gòu)自Sigma;IX－71型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus;Annexin V－FITC檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司;FACSAria流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD。

2 方法

2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng) PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待單層細(xì)胞70%～80%匯合后，用0.25%胰酶消化后傳代培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將PC12細(xì)胞分為以下6組:對(duì)照組(control)、TNF－α組、ActD組、姜黃素組、ActD/TNF－α組和姜黃素+ActD/TNF－α組，調(diào)整藥物終濃度50 μg/L TNF － α、10 μg/L ActD 和5 μmol/L 姜黃素。

2.3 倒置熒光顯微鏡普通光觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞種植于6孔培養(yǎng)板，加藥處理后的細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。最后用Olympus Image－Pro Plus 6.0軟件拍攝細(xì)胞照片并進(jìn)行對(duì)比分析。

2.4 Annexin V－PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后收集，PBS洗滌2次，收集(1～5)×105細(xì)胞，依次加入binding buffer懸浮細(xì)胞 500 μL、Annexin V － FITC 5 μL 和 PI 5 μL，混勻，室溫下避光反應(yīng)10～15 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，PBS洗1次，加入5 μmol/L鈣離子熒光探針Fluo－3 AM，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后離心去除多余染料，用PBS洗1次，PBS懸浮細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.6 海馬腦片長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long－term potentiation，LTP)的誘導(dǎo)和記錄

2.6.1 實(shí)驗(yàn)分組 36只大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只。切成腦片后通過(guò)孵育給藥的方式，用50 mL藥液孵育各組腦片0.5 h，各組給藥情況及劑量同PC12細(xì)胞。

2.6.2 離體海馬腦片的制備 大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后快速斷頭取腦，腦組織放入冰凍的(4℃)通氧人工腦脊液(ACSF)中冰凍2 min，分離海馬并用組織切片機(jī)沿海馬長(zhǎng)軸方向連續(xù)切成400 μm厚的切片，將切好的腦片移入各組預(yù)先經(jīng)氧飽和的ACSF中33℃孵育30 min。

2.6.3 腦片的孵育 實(shí)驗(yàn)采用靜置－灌流兩用界面式浴槽，浴槽上置有尼龍網(wǎng)。腦片置于網(wǎng)上孵育，下面與槽內(nèi) ACSF接觸。孵育過(guò)程通以含95%O2和5%CO2的混合氧，室溫孵育1 h后轉(zhuǎn)入記錄槽準(zhǔn)備記錄。

2.6.4 LTP的誘發(fā)及記錄 絕緣的雙極鎢電極作為刺激電極，每隔30 s給予恒定的電流刺激(50～400 μA)Schaffer側(cè)支，刺激的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間以能產(chǎn)生30%～40%最大反應(yīng)為宜，此為基礎(chǔ)刺激。充以ACSF的玻璃微電極(阻抗為2～5 MΩ)作為記錄電極，將記錄電極插入CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突層100～200 μm，記錄的電活動(dòng)是給予電刺激后CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突層的場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)，經(jīng)放大器 (Axon 200B)放大后，通過(guò)數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon Digidata 1322A)在2.5 kHz頻率下數(shù)字化電信號(hào)，并貯存在電腦上。給予30 min基礎(chǔ)刺激后，用高頻電刺激(high－frequency stimulation，HFS;頻率100 Hz，持續(xù)1 s，串間隔20 s，共2串)刺激 Schaffer側(cè)支軸突，在海馬CA1區(qū)記錄fEPSP的變化，進(jìn)行60 min記錄。其中，第45 min fEPSP起始斜率的值代表LTP的誘發(fā)和變化情況。如果fEPSP起始斜率增幅在20%以上，并且能維持30 min以上則認(rèn)為L(zhǎng)TP成功誘發(fā)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較用單因素方差分析(One－way ANOVA)。LTP實(shí)驗(yàn)采用Original 7.0和pClamp 9.0軟件分析，測(cè)量給予腦片HFS后第45 min fEPSP的起始斜率，以基礎(chǔ)水平的百分?jǐn)?shù)形式表示LTP的幅度。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 姜黃素對(duì)ActD/TNF－α致細(xì)胞形態(tài)變化的影響

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組PC12細(xì)胞體積較大，神經(jīng)突起明顯，細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)。TNF－α組、ActD組和姜黃素組PC12細(xì)胞形態(tài)與正常組無(wú)明顯區(qū)別。ActD/TNF－α組細(xì)胞發(fā)生明顯損傷:體積變小，突起減少變短，細(xì)胞貼壁能力減弱。而姜黃素干預(yù)組細(xì)胞與ActD/TNF－α組細(xì)胞相比，損傷程度明顯改善:突起也有恢復(fù)，細(xì)胞貼壁能力增強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量也明顯增加，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Effect of curcumin(Cur)on morphological changes of PC12 cells treated with ActD/TNF－α.A:control;B:50 μg/L TNF － α;C:10 μg/L ActD，D:5 μmol/L Cur;E:50 μg/L TNF － α +10 μg/L ActD;F:5 μmol/L Cur+50 μg/L TNF － α +10 μg/L ActD.圖1 姜黃素對(duì)ActD/TNF－α誘導(dǎo)PC12細(xì)胞形態(tài)變化的影響

2 姜黃素對(duì)ActD/TNF－α致細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組的凋亡率為4.03% ±0.22%，TNF－α組、ActD組和單獨(dú)姜黃素組的凋亡率與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而ActD/TNF－α處理PC12細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率達(dá)到38.67% ±2.08%，明顯高于正常對(duì)照組細(xì)胞(P＜0.05);姜黃素干預(yù)后細(xì)胞凋亡率為19.67% ±2.52%，與ActD/TNF－α組相比有顯著差異(P＜0.05)，說(shuō)明ActD和TNF－α協(xié)同處理可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞明顯凋亡，姜黃素則可以改善這種損傷，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Effect of curcumin(Cur)on the apoptotic rate of PC12 cells damaged by ActD/TNF－α..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs ActD+TNF－α.圖2 姜黃素對(duì)ActD/TNF－α損傷的PC12細(xì)胞凋亡率的影響

3 姜黃素對(duì)ActD/TNF－α致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響

圖3中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示，TNF－α組、ActD組和單獨(dú)姜黃素組PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ActD/TNF－α組細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。經(jīng)5 μmol/L姜黃素干預(yù)后，細(xì)胞Ca2+熒光強(qiáng)度顯著下降(P＜0.05)。這說(shuō)明ActD/TNF－α可引起PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高，而姜黃素可抑制由ActD/TNF－α引起的PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高。

4 姜黃素對(duì)ActD/TNF－α致海馬CA1區(qū)LTP抑制作用的影響

對(duì)照組給予HFS后，fEPSP起始斜率顯著增大，平均增強(qiáng)幅度為159.52% ±7.46%;TNF－α組、ActD組和單獨(dú)姜黃素組平均增強(qiáng)幅度與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。ActD/TNF－α組給予HFS后fEPSP起始斜率增大不明顯，且很快回到基線水平，平均增強(qiáng)幅度為 116.80% ±7.68%，與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，n=6)。姜黃素與ActD/TNF－α共孵育海馬腦片予以HFS后，fEPSP起始斜率為136.68% ±6.13%，與ActD/TNF－α組相比顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，n=6)。表明本實(shí)驗(yàn)條件下，ActD/TNF－α顯著抑制大鼠海馬神經(jīng)元LTP的產(chǎn)生，而姜黃素可改善ActD/TNF－α對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性的抑制作用，對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元有功能性保護(hù)作用，見(jiàn)圖4。

Figure 3.Effect of curcumin(Cur)on concentrations in Ca2+of PC12 cells exposed to ActD/TNF－α..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs ActD/TNF－α.圖3 姜黃素對(duì)ActD/TNF－α致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響

Figure 4.The long－term potentiation in the CA1 region of rat hippocampal slices in different groups.HFS:high－frequency stimulation;fEPSP:field excitatory postsynaptic potential.圖4 各組大鼠海馬腦片CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)

討 論

神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是大腦發(fā)育過(guò)程中的一種正常生理過(guò)程，但在大腦損傷和疾病狀態(tài)下，凋亡便成為對(duì)大腦有害的因素，導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)元損傷和丟失［4］。研究表明，當(dāng)機(jī)體處于炎癥等多種病理狀態(tài)時(shí)，TNF－α能誘導(dǎo)某些細(xì)胞凋亡，如HAND患者腦內(nèi)TNF－α合成和分泌明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)，TNF－α需與ActD合用才可引發(fā)明顯的肝細(xì)胞凋亡。ActD為轉(zhuǎn)錄抑制劑，可使肝細(xì)胞對(duì)TNF－α的敏感性大大增強(qiáng)［2］。因此本研究采用TNF－α和ActD連用以探究二者的協(xié)同致凋亡作用。篩選出合適的用藥劑量后，我們采用10 μg/L ActD和50 μg/L TNF－α協(xié)同作用PC12細(xì)胞24 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞突觸明顯縮短、胞體皺縮、細(xì)胞數(shù)量也明顯減少，細(xì)胞發(fā)生了明顯損傷，流式細(xì)胞術(shù)也顯示ActD/TNF－α組凋亡率明顯上升，證實(shí)了ActD/TNF－α可協(xié)同誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡。

中藥單體姜黃素具有抗炎、抗HIV－1、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理功效，并且具有毒副作用小、血腦屏障透過(guò)性好等優(yōu)點(diǎn)，可能是治療HAND的前景藥物。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明姜黃素可改善gp120 V3環(huán)所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠的行為學(xué)功能，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白的表達(dá)并提高學(xué)習(xí)記憶能力;保護(hù)gp120 V3環(huán)損傷的大鼠海馬神經(jīng)元突觸，保護(hù)神經(jīng)元突觸形態(tài)及其基本功能，抑制神經(jīng)元的凋亡［5－7］。在此基礎(chǔ)之上，本研究擬觀察姜黃素對(duì)ActD/TNF－α誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響并探明其可能機(jī)制。倒置顯微鏡實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)5 μmol/L的姜黃素可以改善ActD/TNF－α對(duì)細(xì)胞的損傷作用;流式細(xì)胞術(shù)顯示姜黃素可以顯著減少ActD/TNF－α引起的細(xì)胞凋亡。由此我們初步得知姜黃素對(duì)ActD/TNF－α協(xié)同誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

1973年Bliss等［8］通過(guò)高頻電刺激麻醉兔的內(nèi)嗅皮層，興奮海馬表層的穿通纖維，在齒狀回記錄場(chǎng)電位，發(fā)現(xiàn)了LTP效應(yīng)。如今此效應(yīng)被公認(rèn)為神經(jīng)元生理活動(dòng)和信息儲(chǔ)存的客觀指標(biāo)，廣泛用于學(xué)習(xí)記憶過(guò)程的機(jī)制及藥物對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響的研究。本實(shí)驗(yàn)中我們采用離體大鼠海馬腦片，運(yùn)用細(xì)胞外微電極記錄技術(shù)觀察ActD/TNF－α對(duì)大鼠海馬腦片CA1區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性的影響。發(fā)現(xiàn)ActD/TNF－α處理后，LTP的誘發(fā)明顯受到抑制，而用姜黃素和ActD/TNF－α共同孵育海馬腦片后，海馬腦片的 LTP部分恢復(fù)，fEPSP的起始斜率與ActD/TNF－α組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此進(jìn)一步證實(shí)，姜黃素可以部分拮抗ActD/TNF－α造成的大鼠海馬LTP抑制，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的正常功能。

那么姜黃素究竟是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用的呢?針對(duì)此問(wèn)題，我們進(jìn)行了更近一步的研究。在神經(jīng)系統(tǒng)里，鈣離子是重要的細(xì)胞內(nèi)信使，是維持突觸傳遞、可塑性和神經(jīng)元發(fā)育的重要物質(zhì)［9］?！扳}調(diào)整點(diǎn)”的假說(shuō)認(rèn)為:細(xì)胞內(nèi)適宜濃度的Ca2+可以促使生長(zhǎng)錐的正常生長(zhǎng)、延伸，而Ca2+濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)則會(huì)抑制神經(jīng)突起的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用Fluo－3 AM標(biāo)記技術(shù)測(cè)定胞內(nèi)游離Ca2+的變化，發(fā)現(xiàn)50 μg/L TNF－ α 和 10 μg/L ActD 共孵育可以顯著升高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，而用姜黃素共同孵育后，ActD/TNF－α造成的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的高濃度顯著降低。這個(gè)研究結(jié)果提示，姜黃素發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制可能跟降低PC12細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度、抑制胞內(nèi)發(fā)生鈣超載引起的細(xì)胞不可逆損傷有關(guān)。

［1］Glass JD，F(xiàn)edor H，Wesselingh SL，et al.Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain:correlations with dementia［J］.Ann Neurol，1995，38(5):755－762.

［2］胡 聰，韓聚強(qiáng)，孫輝臣，等.TNFα/ActD誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.肝臟，2001，6(2):114，144.

［3］Cole GM，Teter B，F(xiàn)rautschy SA.Neuroprotective effects of curcumin［J］.Adv Exp Med Biol，2007，595:197 －212.

［4］Li R，Yang L，Lindholm K，et al.Tumor necrosis factor death receptor signaling cascade is required for amyloidbeta protein － induced neuron death［J］.J Neurosci，2004，24(7):1760 －1771.

［5］Tang H，Lu D，Pan R，et al.Curcumin improves spatial memory impairment induced by human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein 120 V3 loop peptide in rats［J］.Life Sci，2009，85(1－2):1－10.

［6］董 軍，陸大祥，潘 銳，等.姜黃素對(duì)gp120所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用及機(jī)制研究［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2008，24(4):328－331.

［7］黃 濤，董 軍，陸大祥，等.CREB在姜黃素改善gp120所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙中的作用［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2008，29(4):362－366.

［8］Bliss TV，Lomo T.Long－lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path［J］.J Physiol，1973，232(2):331－356.

［9］Stevens TR，Krueger SR，F(xiàn)itzsimonds RM，et al.Neuroprotection by nicotine in mouse primary cortical cultures involves activation of calcineurin and L－type calcium channel inactivation［J］.J Neurosci，2003，23(31):10093－10099.