李友發(fā)，富昊偉，陸 強(qiáng)

(浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016)

潮霉素B是一種氨基糖苷類抗生素，可破壞細(xì)胞中核糖體的功能。水稻中潮霉素通過單鍵細(xì)胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長因子EF-2的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制肽鏈的延長，破壞細(xì)胞功能，使敏感組織褐化死亡而呈現(xiàn)毒性癥狀。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)導(dǎo)入水稻后，使細(xì)胞具有了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)活性，從而可忍耐較高濃度的潮霉素毒性，因此，在水稻轉(zhuǎn)基因育種中，hpt基因已成為最有效的選擇基因之一。先期通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)育的Bt克螟稻都攜帶潮霉素抗性基因Hyg，在商業(yè)化生產(chǎn)競(jìng)爭(zhēng)中處于不利地位。在嘗試通過誘變或遺傳學(xué)手段將Hyg基因與Bt基因分離的研究中，對(duì)群體中潮霉素敏感植株的快速、有效的篩選方法至關(guān)重要。有關(guān)潮霉素的處理效果除對(duì)浸種催芽［1］或離體葉片［2］有簡(jiǎn)短報(bào)道外，也曾有用潮霉素處理水稻活體的幼苗的報(bào)道［3］。在實(shí)際應(yīng)用中，我們發(fā)現(xiàn)水稻幼苗鑒別雖然有效，但仍存在較多干擾因素，特別是在應(yīng)用于誘變?nèi)后w中低頻率的突變株篩選時(shí)，幼苗期的觀察效果不夠直觀。本研究中我們探索了水稻潮霉素敏感型在穗期的鑒定方法，并對(duì)其在大群體篩選試驗(yàn)中的應(yīng)用效果進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

參試水稻品種為克螟稻R1號(hào)與R28?？嗣綬1號(hào)系浙江大學(xué)核農(nóng)所選育的帶有hpt基因的Bt轉(zhuǎn)基因“三系”秈稻恢復(fù)系，R28系嘉興市農(nóng)科院育成的常規(guī)秈稻恢復(fù)系，不帶hpt基因。

試驗(yàn)用潮霉素B為Roche公司產(chǎn)品，用清水配成50，75，100 mg·L－13種濃度水溶液。注射方法為:各處理選擇克螟稻R1號(hào)與R28各20株，當(dāng)主穗處于幼穗分化八期(穗將伸而未破苞見穗階段)時(shí)，用醫(yī)用小針頭將上述濃度的潮霉素溶液注入穗苞，每個(gè)穗苞約注入0.5～1.0 mL。植株抽穗后，觀察稻穗的中毒癥狀并統(tǒng)計(jì)中毒穗粒數(shù)。噴施方法為:各處理群體40株，噴施時(shí)期為始穗期—齊穗期，此時(shí)所有植株主穗已抽出，最遲分蘗尚未抽，有較多中間穗正在抽穗過程中。用手持小噴霧器將潮霉素溶液均勻充分地噴施到穗層。植株完全抽穗后，觀察主穗的中毒癥狀并統(tǒng)計(jì)主穗的總粒數(shù)和有中毒癥狀的穗粒數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中毒癥狀

試驗(yàn)中，克螟稻R1號(hào)無論注射還是噴施，稻穗均沒有出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)對(duì)潮霉素有很好的抗性。而R28則表現(xiàn)出不同程度的穗中毒癥狀。R28抽穗前穗苞注射的典型中毒癥狀為部分穗?？菟?圖1中A)，這些枯死穎花呈灰白色，不開花散粉，也不能結(jié)實(shí)，或整個(gè)穗苞枯死不能抽穗(圖1中B);始穗至齊穗期噴施的典型中毒癥狀為部分穎花穎殼變黃褐色(圖1中C)，沒有出現(xiàn)穗苞枯死現(xiàn)象。由于稻穗長度20～30 cm，穗粒枯死、穗苞枯死或穎殼黃褐色，這些中毒癥狀與正常淡綠色的稻穗差異非常明顯，因此在較遠(yuǎn)的距離就可以目測(cè)區(qū)分。

圖1 潮霉素處理水稻穗期的中毒癥狀

2.2 劑量效應(yīng)

潮霉素的毒性反應(yīng)存在劑量效應(yīng)，主要表現(xiàn)在注射處理時(shí)，在50，75，100 mg·L－1處理下，枯死穗粒數(shù)分別為26.3%，27.9%，32.7%，呈增加趨勢(shì);各20株注射植株中分別有1，2，3株植株穗苞枯死，也隨著劑量增加而增加。噴施試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，潮霉素中毒癥狀表現(xiàn)較注射不明顯，主要表現(xiàn)不是枯死，而是穎殼變黃褐色或褐色，這些呈黃褐色的穎花仍能開花散粉，也能正常結(jié)實(shí)。這類褐色穎殼的穗粒數(shù)分別為9.70%，14.6%，16.2%，也隨著劑量的增加而增加。

表1 水稻R28注射和噴施潮霉素中毒的劑量效應(yīng)

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)是在我們對(duì)水稻活體幼苗潮霉素敏感性研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展的對(duì)水稻活體穗期潮霉素敏感性的研究。研究表明，抽穗前穗苞注射潮霉素的，其毒性癥狀主要為穗?？菟阑蛩氚菟?穗期噴施則表現(xiàn)為穎殼黃褐色但仍能正常開花結(jié)實(shí)。其表現(xiàn)的毒性癥狀均較葉片斑點(diǎn)狀毒性癥狀易區(qū)分。在對(duì)12萬株誘變M2大群體篩選中進(jìn)一步證明該毒性癥狀的可應(yīng)用性。

先期報(bào)道中提出用潮霉素噴施水稻幼苗葉片的方法來鑒別敏感型植株［3］，但在實(shí)際應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn)該方法雖然有效，但存在較多干擾因素，主要表現(xiàn)為:因幼苗很小且秧田期播種稠密，噴施時(shí)易于漏噴幼苗;幼苗處于快速生長過程中，噴施后7～10 d即會(huì)有1～2張新葉出現(xiàn)，這些新葉是不會(huì)出現(xiàn)斑點(diǎn)的，這對(duì)觀察造成干擾;最主要的干擾是水稻葉片的生理性病斑，水稻幼苗在秧苗期會(huì)出現(xiàn)各種黃褐斑，如由銹病引起、缺微量元素引起等，更對(duì)鑒別造成很大干擾。特別是作為誘變育種低頻率的突變性狀的篩選方法，幼苗期觀察效果不夠直觀的缺點(diǎn)更加明顯。而穗期觀察，由于水稻的穗長一般有20 cm左右，且穗?？菟阑螯S褐斑與正常稻穗的顏色的區(qū)分是十分明顯的。穗期噴施篩選效果的高效直觀，在誘變突變體的篩選方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

從篩選成本來看，幼苗期篩選在潮霉素用量方面顯然節(jié)省很多。如同樣的12萬株群體，幼苗期處理，估算只需0.5～1.0 g的潮霉素，而穗期噴施，約需150 kg藥液，潮霉素實(shí)際用量約為15 g，但如果采用雙叢或多叢移栽的方式，則同樣的群體，可成倍減少潮霉素的用量。

標(biāo)準(zhǔn)基因是遺傳工程中的重要工具基因，一般都與目的基因以連鎖的方式構(gòu)建在同一T-DNA上。但是，在獲得轉(zhuǎn)基因植株后，從應(yīng)用角度講它們就成了多余的甚至不受歡迎的部分，特別是在轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)價(jià)中，對(duì)hpt標(biāo)記基因安全性的憂慮是目前我國轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)價(jià)中的一個(gè)重點(diǎn)［4］。雖然通過無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物(marker-free transgenic plants，MFTP)培育技術(shù)已可獲得不帶htp標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因材料［5－8］，但這些技術(shù)只適用于新的MFTP的培育，無法應(yīng)用于已經(jīng)育成并具有重要應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的剔除。如克螟稻及其衍生親本［9－10］，由于帶有 htp基因，已成為獲得安全證書的一種制約。通過人工理化誘變，將現(xiàn)有的有重大應(yīng)用價(jià)值轉(zhuǎn)基因材料中的htp基因剔除或部分片段失活，則可在一定程度上排除這種安全性顧慮。

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