戴 甄，張 波，王 剛，藍(lán)小玲，楊曉琴，魏 屹，李學(xué)如

(1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都 611130)

1,3-二羥基丙酮(Dihydroxyacetone，DHA)是一種重要的醫(yī)藥化工中間體，在精細(xì)化工、食品、醫(yī)藥和化妝品等工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1～3]。目前，國外已實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)化微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA；國內(nèi)在發(fā)酵法生產(chǎn)DHA菌株篩選和工藝優(yōu)化方面也取得了很大進(jìn)展，但與國外相比，還存在一定差距[4～6]。因此，篩選高產(chǎn)DHA菌株意義重大。

傳統(tǒng)物理和化學(xué)誘變法選育高產(chǎn)菌株存在作用目標(biāo)不明確、有效突變率低、工作量大、篩選周期長等缺點(diǎn)，尋找快捷、高效篩選高產(chǎn)菌株的方法一直是工業(yè)微生物育種研究者的目標(biāo)[7]。

Shima 等[8]于1996 年發(fā)現(xiàn)，在Streptomyceslividans核糖體S12 蛋白的編碼基因rpsL中引入某些點(diǎn)突變，可激活該菌株中沉默的抗生素生物合成基因，導(dǎo)致放線紫紅素的超量合成。隨后大量的研究表明，微生物獲得特定類型的抗性突變，不僅反映了其核糖體或RNA 多聚酶上相關(guān)靶位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的改變，也對突變菌株次級代謝產(chǎn)物的生物合成能力影響顯著[9，10]。由于這些突變與出發(fā)菌株獲得的藥物抗性有關(guān)，由此發(fā)展起來的抗生素抗性篩選技術(shù)，因其實(shí)驗(yàn)操作簡便、效果顯著而在微生物菌株選育中得到廣泛應(yīng)用。

作者在此以不動桿菌(Acinetobactersp.)Asp16為出發(fā)菌株，通過UV和60Co誘變結(jié)合鏈霉素抗性平板篩選，選育高轉(zhuǎn)化甘油產(chǎn)DHA菌株，并對誘變條件進(jìn)行研究，擬為DHA的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

不動桿菌(Acinetobactersp.)Asp16，自行篩選獲得。

斜面和平板固體培養(yǎng)基(g·L-1)：甘油50.0，葡萄糖50.0，酵母膏10.0，碳酸鈣3.0，瓊脂18.0，pH值自然。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：甘油50.0，葡萄糖50.0，酵母膏10.0，碳酸鈣3.0，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：甘油140.0，酵母膏5.0，碳酸鈣7.0，pH值自然。

1.2 試劑與儀器

二苯胺，1,3-二羥基丙酮，硫酸鏈霉素(Sigma 公司)。

LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津；V-1100D型可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)；ZHWY211B型旋轉(zhuǎn)搖床,上海智城。

1.3 方法

出發(fā)菌株Asp16→分離純化→鏈霉素平板確定最低殺菌濃度→新鮮斜面菌種→菌懸液→UV/60Co誘變→鏈霉素平板分離→挑取單菌落→初篩、復(fù)篩→正突變菌株→突變株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)→高產(chǎn)突變株。

(1)紫外(UV)誘變：將出發(fā)菌株接種在種子培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌2次后懸浮于生理鹽水中,調(diào)整菌體濃度為108個·mL-1左右；在距30 W紫外燈光源30 cm處照射一定時間；涂布于甘油含量為14%的鏈霉素固體培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d；挑選單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

(2)γ-射線(60Co)誘變：分別以100～600 Gy輻射劑量對過夜培養(yǎng)的斜面試管中的菌體進(jìn)行60Co照射，然后在甘油含量為14%的鏈霉素固體培養(yǎng)基平板上分離單菌落，30 ℃培養(yǎng)一定時間，挑選單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

(3)發(fā)酵種子培養(yǎng)：挑取一環(huán)新鮮斜面菌種，接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、250 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵用種子培養(yǎng)液。

(4)搖瓶發(fā)酵：按10%接種量將種子培養(yǎng)液接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、250 r·min-1搖床培養(yǎng)60 h，測定發(fā)酵液中DHA含量。

1.4 分析檢測

1.4.1 最低殺菌濃度的測定

取30 ℃搖瓶培養(yǎng)12 h的不動桿菌Asp16菌液0.1 mL，分別涂布于含不同濃度鏈霉素的培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)3 d。觀察平板上的菌落生長情況，以未長菌落的最低鏈霉素濃度作為最低殺菌濃度。

1.4.2 DHA含量測定

采用二苯胺顯色法[11]測定DHA含量：將發(fā)酵液離心除去菌體，取1 mL上清液置于500 mL容量瓶中定容，混勻；取1 mL稀釋液與9 mL顯色液(濃硫酸∶無水乙酸∶二苯胺=6 mL∶54 mL∶0.6 g)在比色管中混勻，沸水浴15 min，冷卻后，用分光光度計(jì)測定615 nm處吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]計(jì)算對應(yīng)的DHA含量。

HPLC色譜條件[6]：Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為5%甲醇的水溶液(加入0.05% H3PO4調(diào)pH值至3.0)；流速1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長200 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 DHA含量測定方法的確定

分別采用二苯胺顯色法和高效液相色譜法測定DHA含量，結(jié)果如表1所示。

表1 二苯胺顯色法和HPLC法測定的DHA含量比較

由表1可知，兩種方法測定的相關(guān)系數(shù)R2都在0.99以上，測得的DHA含量相近。可見，兩種方法都能比較精確地測定發(fā)酵液中DHA含量，尤其是二苯胺顯色法簡單、快捷，特別適合于菌株選育過程中大量樣品測定。

2.2 最低殺菌濃度

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鏈霉素濃度≥25 mg·L-1的培養(yǎng)基平板上未長出菌落。因此，確定鏈霉素濃度25 mg·L-1為菌株Asp16的最低殺菌濃度。

2.3 菌株的誘變與篩選

2.3.1 紫外誘變對Asp16正突變率的影響

取5 mL單菌體懸浮液于內(nèi)置磁力攪拌子的無菌平皿中，置于30 W紫外燈下開蓋恒溫振蕩照射不同時間(20 s、30 s、40 s、50 s、70 s)，然后稀釋涂布鏈霉素平板，培養(yǎng)3 d后，隨機(jī)挑選40個單菌落，以Asp16為對照，搖瓶篩選?？疾熳贤庹T變時間對Asp16正突變率的影響，結(jié)果見表2。

表2 紫外誘變時間對Asp16正突變率的影響

由表2可知，隨著紫外誘變時間的延長，Asp16的正突變率先升高后降低；當(dāng)紫外誘變時間為40 s時，Asp16的正突變率最高，達(dá)56.8%；當(dāng)紫外誘變時間為70 s時，Asp16的正突變率降到30.4%。

2.3.260Co誘變對Asu95致死率的影響

用不同劑量的60Co誘變Asu95(Asp16紫外誘變40 s后的突變株)，鏈霉素平板分離，待菌落形成后，先進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，然后各處理劑量隨機(jī)挑選50個單菌落，以Asu95為對照，經(jīng)搖瓶篩選后，計(jì)算正突變率，結(jié)果見表3。

表3 60Co誘變劑量對Asu95致死率和正突變率的影響

由表3可知，在60Co誘變劑量為100～200 Gy時，致死率與誘變劑量成正比；在60Co誘變劑量為300～400 Gy時，致死率和正突變率變化不大。因此，從誘變育種規(guī)律上考慮，選擇逐漸減少60Co誘變劑量的方法。

2.3.3 復(fù)合誘變處理

將出發(fā)菌株Asp16按圖1進(jìn)行誘變處理后，涂布鏈霉素平板分離；每次處理挑取150～200個單菌落，進(jìn)行搖瓶初篩和復(fù)篩，獲得系列突變株，最終篩選出DHA高產(chǎn)突變株Asr168。

圖1 復(fù)合誘變處理過程

2.4 出發(fā)菌株與突變株產(chǎn)DHA的比較(表4)

表4 Asp16與突變株產(chǎn)DHA的比較

由表4可知，經(jīng)UV和60Co誘變處理，并結(jié)合鏈霉素抗性平板篩選得到的Asr168產(chǎn)DHA達(dá)136 g·L-1，比出發(fā)菌株Asp16提高200%，發(fā)酵周期縮短了24 h，生產(chǎn)效率從15 g·L-1·d-1上升到68 g·L-1·d-1，提高近350%。這說明，UV和60Co誘變處理結(jié)合鏈霉素抗性平板篩選對提高DHA的生產(chǎn)效率是有效的；多次誘變具有明顯突變的效果，尤其以60Co誘變更為有效。同時，突變株比出發(fā)菌株的菌落大，淺黃色，為圓形，凸?fàn)睢?/p>

2.5 突變株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將選育出來的突變株Asr168進(jìn)行斜面菌種傳代實(shí)驗(yàn)，第1代、第3代、第6代、第10代的DHA產(chǎn)量(g·L-1)分別為135.0、136.8、135.5、134.0，連續(xù)傳代10 次，其DHA產(chǎn)量沒有顯著差異，均穩(wěn)定在134.0 g·L-1以上。表明所獲得的突變株Asr168遺傳性能穩(wěn)定，是產(chǎn)DHA的優(yōu)良菌株,具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

將UV和60Co誘變與鏈霉素抗性平板篩選技術(shù)結(jié)合，篩選獲得1株遺傳性能穩(wěn)定、高轉(zhuǎn)化甘油產(chǎn)DHA的突變株Asr168，DHA產(chǎn)量達(dá)到136 g·L-1，較出發(fā)菌株Asp16提高200%。為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)DHA打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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