劉麗娟,薛亞平,鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

5-甲基吡嗪-2-羧酸是一種重要的醫(yī)藥中間體，可用于合成第二代口服降血糖藥物格列吡嗪(Glypizide)、新型抗高血壓藥物阿西莫司(Acipimox)、抗結(jié)核藥物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等。目前，5-甲基吡嗪-2-羧酸工業(yè)生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和生物合成法，其中化學(xué)合成法存在過(guò)程復(fù)雜、選擇性差、產(chǎn)率低、產(chǎn)物難分離、污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)[1～8]，而生物合成法因具有高效、高選擇性、條件溫和、環(huán)境友好等特點(diǎn)，近年來(lái)得到快速發(fā)展。研究表明，單加氧酶可以對(duì)吡嗪等雜環(huán)類(lèi)化合物進(jìn)行高效、高區(qū)域性的加氧反應(yīng)。研究者陸續(xù)篩選出Ralstonia/Burkholderiasp.DSM6920[9]、RhodococcuserythropolisDP-45[10]、Pseudomonasputida[11，12]等具有單加氧酶活性的菌株，其中惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)能夠選擇性地將2,5-二甲基吡嗪對(duì)稱(chēng)甲基中的一個(gè)甲基氧化為羧基[11]，且具有很強(qiáng)區(qū)域選擇性，在5-甲基吡嗪-2-羧酸的生產(chǎn)中應(yīng)用潛力巨大。瑞士的Lonza公司利用含二甲苯單加氧酶的菌株在批次補(bǔ)料反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)了5-甲基吡嗪-2-羧酸的微生物法生產(chǎn)[13]。目前，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)這方面的研究和報(bào)道。

作者從土壤中篩選出一株產(chǎn)二甲苯單加氧酶菌株，可以有效地將2,5-二甲基吡嗪氧化為5-甲基吡嗪-2-羧酸，對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定及16S rDNA分析，并對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

從化工廠的排污口附近、菜園、果園、植物叢等處采集100余份土樣用以菌種篩選。

Biolog(GEN Ⅲ)微生物自動(dòng)鑒定專(zhuān)用試劑及培養(yǎng)基等，Biolog公司；基因組DNA快速提取試劑盒，MP Bio公司；DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，Axygen公司。其它試劑均購(gòu)自Sigma公司。

VFD-M型搖床，樂(lè)山長(zhǎng)征制藥有限公司；LC-10AS型高效液相色譜儀，日本島津公司；XL30型環(huán)境掃描電鏡，荷蘭Philips公司；PTC200型擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

菌種保藏培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂 20，pH值7.0。

種子液培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母膏 5，蛋白胨 10，NaCl 5，pH值7.0。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：先配好A、B、C 3種母液，然后按A∶B∶C∶蒸餾水=10∶2.5∶0.1∶87.4(體積比)混合均勻后高壓蒸汽滅菌。A(g·L-1)：(NH4)2SO420，Na2HPO4·2H2O 25，KH2PO410，NaCl 30；B(g·L-1)：MgCl2·6H2O 16，CaCl2·2H2O 0.58，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.032；C(g·L-1)：ZnSO4·7H2O 0.1，MnCl2·4H2O 0.09，H3BO30.3，CoCl2·6H2O 0.2，CuCl2·2H2O 0.01，NiCl2·6H2O 0.02，Na2MoO4·2H2O 0.03，EDTA·Na2·2H2O 5.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.0，pH值7.0。

富集培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)方法：在500 mL搖瓶中加入100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，將對(duì)二甲苯加入搖瓶中間的小管中，以蒸發(fā)出來(lái)的對(duì)二甲苯蒸汽為碳源(圖1)，置于150 r·min-1、30 ℃的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。

圖1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)示意圖

1.3 菌株篩選及鑒定

1.3.1 菌株篩選

取約1 g土樣進(jìn)行富集培養(yǎng)，置于150 r·min-1、30 ℃的搖床上富集2次，每次2 d。然后將稀釋菌液涂布于平板的菌種保藏培養(yǎng)基上，待1～2 d長(zhǎng)出單菌落后，挑取不同形態(tài)單菌落接種到菌種保藏培養(yǎng)基上于4 ℃冰箱保存。將初篩得到的菌株接種至搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)(搖瓶中間的小管子加入1 mL的對(duì)二甲苯，對(duì)二甲苯作為唯一碳源保證菌體生長(zhǎng)，同時(shí)可誘導(dǎo)二甲苯單加氧酶產(chǎn)生)，培養(yǎng)12 h后加入100 μL 2,5-二甲基吡嗪。培養(yǎng)2 d后，取樣離心，過(guò)膜處理后用高效液相色譜檢測(cè)。選擇有催化活性的菌株，取轉(zhuǎn)化活性最高的菌株ZJB-LLJ進(jìn)行鑒定及搖瓶轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 生理生化鑒定

利用Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株ZJB-LLJ進(jìn)行94種表型測(cè)試，包括71種碳源利用情況檢測(cè)以及23種化學(xué)敏感性檢測(cè)：將菌株接種于BUG平板培養(yǎng)基，33 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，用無(wú)菌棉簽將平板上的菌體洗下，與接種液(IF-A)混合，制成菌懸液，用濁度計(jì)調(diào)整至95%T。用8孔電動(dòng)加液器將菌懸液分別加入微孔鑒定板的各孔中，每孔100 μL。將微孔鑒定板放在33 ℃培養(yǎng)箱中，分別在培養(yǎng)12 h和24 h后將其置于Biolog讀數(shù)儀上讀取結(jié)果。

1.3.3 遺傳學(xué)鑒定

以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用設(shè)計(jì)一對(duì)引物(p16S-8：5′-AGA GTTT GAT CCT GGC TCA G-3′及p16S-1541：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′)擴(kuò)增菌株ZJB-LLJ的16S rDNA序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.9%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

1.4.1 轉(zhuǎn)化進(jìn)程實(shí)驗(yàn)

從斜面上挑取一環(huán)菌體接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)(500 mL搖瓶裝液量為100 mL、30 ℃、150 r·min-1，以下沒(méi)有特別說(shuō)明均為此條件)。0～12 h，每2 h取樣一次；12～36 h，每4 h取樣一次。采用比濁法測(cè)菌懸液650 nm處的吸光度以確定其生物量。

以5%的接種量將12 h的種子液接入已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中(搖瓶小管中加入1 mL對(duì)二甲苯)培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪200 μL。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程每4 h取樣一次直到60 h。

1.4.2 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

以5%的接種量接種12 h的種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基中(搖瓶小管中加入1 mL對(duì)二甲苯)，置于30 ℃搖床中培養(yǎng)12 h后，加入底物2,5-二甲基吡嗪200 μL(100 μL對(duì)應(yīng)底物濃度為1 g·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每12 h取樣一次。用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值7～8保持恒定。

固定其它條件不變，考察碳源(二甲苯、對(duì)二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯)、底物加入時(shí)間(0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h)、溫度(20 ℃、30 ℃、40 ℃)、發(fā)酵培養(yǎng)基pH值(6、7、8、9、10)、初始底物濃度(1 g·L-1、2 g·L-1、3 g·L-1、4 g·L-1、5 g·L-1、6 g·L-1、7 g·L-1、8 g·L-1、9 g·L-1、10 g·L-1)對(duì)產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響。其中考察pH值影響時(shí)取樣時(shí)間調(diào)整為培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、60 h；考察初始底物濃度時(shí)：1～5 g·L-1每12 h取樣一次直到120 h；6～10 g·L-1每24 h取樣一次直到312 h。

最后考察分批流加的影響：按上述方法培養(yǎng)12 h加入100 μL 2,5-二甲基吡嗪之后，每12 h流加100 μL 2,5-二甲基吡嗪直到144 h,之后每24 h流加100 μL 2,5-二甲基吡嗪直到480 h。每次加底物前取樣一次并調(diào)節(jié)pH值在7～8之間。培養(yǎng)至528 h再取樣一次。

1.5 分析與檢測(cè)

先測(cè)樣品OD650值及pH值，然后12 000 r·min-1離心6 min，取上清過(guò)膜處理后用高效液相色譜檢測(cè)。色譜條件為：ODS C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特)；流動(dòng)相為乙腈-水(3∶7，體積比)，流速1.0 mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃。轉(zhuǎn)化液經(jīng)過(guò)減壓蒸餾，然后冷藏降溫，用濃鹽酸酸析得部分產(chǎn)物，酸析完的母液用戊酮萃取，萃取液減壓蒸餾得部分產(chǎn)物，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

實(shí)驗(yàn)初篩得到85株菌，復(fù)篩得到3株可以將2,5-二甲基吡嗪選擇性氧化為5-甲基吡嗪-2-羧酸的菌株，從中選出一株氧化活性最強(qiáng)的菌株ZJB-LLJ，菌落形態(tài)較小(圖2a)，無(wú)褶皺，圓形，邊緣光滑，有光澤，乳黃色，半透明。掃描電鏡觀察細(xì)胞呈橢球形，長(zhǎng)約0.8 μm，直徑約0.4 μm(圖2b)。

圖2 菌株ZJB-LLJ單菌落形態(tài)(a)和掃描電鏡下的形態(tài)(b)

2.2 菌株ZJB-LLJ的生理生化鑒定結(jié)果(表1、表2)

表1 菌株ZJB-LLJ對(duì)Biolog GEN Ⅲ板上71種碳源的利用能力

表2 菌株ZJB-LLJ對(duì)Biolog GEN Ⅲ板上23種化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)敏感性

由表1可知，菌株ZJB-LLJ可較強(qiáng)利用27種碳源，對(duì)蔗糖等44種碳源不能利用或利用能力較弱。由表2可知，菌株ZJB-LLJ在pH值低于5、NaCl濃度高于4%下不能生長(zhǎng)，另外對(duì)梭鏈孢酸等15種化學(xué)物質(zhì)敏感。Biolog系統(tǒng)鑒定菌株ZJB-LLJ為Pseudomonasputida。

2.3 菌株ZJB-LLJ的遺傳學(xué)鑒定

2.3.1 16S rDNA序列擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增成功獲得了長(zhǎng)約為1.5 kb的片段，將經(jīng)PCR擴(kuò)增的片段克隆到pMD18-T(TaKaRa)、抽提質(zhì)粒后的含有本實(shí)驗(yàn)獲得的16S rDNA片段的重組質(zhì)粒，經(jīng)上海生工生物工程有限公司測(cè)序得到16S rDNA全序列，長(zhǎng)度為1529 bp，該序列在GenBank上的登錄號(hào)為JQ824856。

2.3.2 菌種屬種的確定

測(cè)得的基因序列通過(guò)Blast 程序與GenBank 中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，測(cè)得的16S rDNA 全序列用CLUSTAL W ver.1.81A 軟件包進(jìn)行排序[14]，利用MEGA version 2.1[15]軟件包中的Kimura2-Parameter Distance模型計(jì)算進(jìn)化距離，再用Neighour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，1000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值(Bootstrap)，以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的置信度。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于16S rDNA的菌株ZJB-LLJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

由圖3可知，微生物ZJB-LLJ與Pseudomonasputida的遺傳距離最小，同源性達(dá)99%，由此可以確定該菌株為Pseudomonasputida，中文名稱(chēng)為惡臭假單胞菌，該結(jié)果與Biolog的鑒定結(jié)果相吻合。該菌種已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2011395。

2.4 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.4.1 底物與產(chǎn)物的高效液相色譜分析和質(zhì)譜分析

2,5-二甲基吡嗪與5-甲基吡嗪-2-羧酸的標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵轉(zhuǎn)化液的液相色譜見(jiàn)圖4。

圖4 2,5-二甲基吡嗪與5-甲基吡嗪-2-羧酸的液相色譜圖

由圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵轉(zhuǎn)化液的保留時(shí)間一致。

發(fā)酵轉(zhuǎn)化液經(jīng)質(zhì)譜分析，ESI-MS，m/z：139(M+1)，與5-甲基吡嗪-2-羧酸分子量一致。

2.4.2 轉(zhuǎn)化進(jìn)程

測(cè)得菌株ZJB-LLJ轉(zhuǎn)化2,5-二甲基吡嗪為5-甲基吡嗪-2-羧酸的過(guò)程曲線(xiàn)見(jiàn)圖5。

圖5 菌株ZJB-LLJ轉(zhuǎn)化2,5-二甲基吡嗪為5-甲基吡嗪-2-羧酸的過(guò)程曲線(xiàn)

由圖5可知，菌株從5 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，因此后續(xù)的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)選擇12 h的種子液。轉(zhuǎn)化過(guò)程中，菌體量不斷增加，培養(yǎng)60 h時(shí)OD650最大，為0.48。培養(yǎng)12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪，底物濃度由1.71 g·L-1逐漸減小，培養(yǎng)44 h時(shí)出現(xiàn)最小值0.69 g·L-1；同時(shí)產(chǎn)物5-甲基吡嗪-2-羧酸濃度逐漸增大，44 h后達(dá)到0.65 g·L-1，接近最大值，由此，可選擇48 h取樣。pH值由6.8逐漸減小，52 h時(shí)達(dá)到最小值5.2，之后又有所回升，這可能是因?yàn)榫N生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期釋放出堿性物質(zhì)。

2.4.3 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.4.3.1 碳源(圖6)

圖6 不同碳源對(duì)產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

由圖6可知，二甲苯、對(duì)二甲苯、間二甲苯為碳源及誘導(dǎo)劑的產(chǎn)物產(chǎn)生趨勢(shì)基本一樣，培養(yǎng)60 h時(shí)產(chǎn)物濃度達(dá)到最高，分別為0.52 g·L-1、0.50 g·L-1和0.49 g·L-1，但加對(duì)二甲苯前12 h產(chǎn)物積累的速度明顯要快。而加鄰二甲苯的整個(gè)過(guò)程沒(méi)有產(chǎn)物積累。另外，對(duì)二甲苯的價(jià)格及毒性較低，綜合考慮，選擇對(duì)二甲苯為碳源，并誘導(dǎo)單加氧酶的產(chǎn)生。

2.4.3.2 底物加入時(shí)間(圖7)

圖7 底物加入時(shí)間對(duì)產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

由圖7可知，0 h即轉(zhuǎn)接完種子液后立即加入底物的產(chǎn)物濃度為0.24 g·L-1；12 h之前，隨著底物加入時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物濃度逐漸增大；12 h時(shí)加入底物，產(chǎn)物濃度最大，為0.63 g·L-1；此后隨著底物加入時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，產(chǎn)物濃度開(kāi)始減小。因此，選擇底物加入時(shí)間為12 h。

2.4.3.3 培養(yǎng)溫度(圖8)

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

由圖8可知，反應(yīng)12 h時(shí)30 ℃與40 ℃的產(chǎn)物濃度都大于0.21 g·L-1，20 ℃的產(chǎn)物濃度較低，為0.08 g·L-1；30 ℃的產(chǎn)物積累速度明顯高于20 ℃與40 ℃，在60 h時(shí)產(chǎn)物濃度達(dá)到最大值1.89 g·L-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于20 ℃和40 ℃的最大產(chǎn)物濃度。因此，選擇培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.4.3.4 pH值(圖9)

圖9 pH值對(duì)產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

由圖9可知，pH值為8時(shí)整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程的產(chǎn)物積累量都為最大，pH值為7、 8、 9的最終產(chǎn)物濃度均達(dá)到1.41 g·L-1左右，pH值為6、10的最終產(chǎn)物濃度較低，分別為1.18 g·L-1、0.55 g·L-1。這說(shuō)明中性偏堿性的轉(zhuǎn)化環(huán)境最適合產(chǎn)物的積累。

2.4.3.5 初始底物濃度(圖10)

由圖10可知，初始底物濃度越大，反應(yīng)速度越慢?？赡艽嬖谝欢ǖ牡孜镆种?。初始底物濃度為1 g·L-1、2 g·L-1、3 g·L-1、4 g·L-1、5 g·L-1、6 g·L-1、7 g·L-1時(shí)，反應(yīng)分別在36 h、48 h、120 h、120 h、120 h、240 h、240 h時(shí)基本完全，最終產(chǎn)物濃度分別為1.02 g·L-1、1.56 g·L-1、2.02 g·L-1、2.41 g·L-1、2.52 g·L-1、6.35 g·L-1、6.53 g·L-1；初始底物濃度為8 g·L-1、9 g·L-1、10 g·L-1時(shí)，在最后312 h取樣的產(chǎn)物濃度分別達(dá)到7.42 g·L-1、7.05 g·L-1、6.00 g·L-1，但并未達(dá)到最大值，考慮轉(zhuǎn)化時(shí)間太長(zhǎng)沒(méi)有繼續(xù)取樣。從圖10還可知，初始底物濃度過(guò)大時(shí)，開(kāi)始階段的底物抑制較強(qiáng)烈，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物生成速率顯著加快，且菌株度過(guò)抑制期后，隨著初始底物濃度的增大，產(chǎn)物積累速率也明顯提高。這表明，菌株對(duì)環(huán)境有一定的適應(yīng)能力，當(dāng)菌株適應(yīng)了高濃度底物的環(huán)境后，就可以快速對(duì)底物進(jìn)行氧化，且氧化速率隨著底物初始濃度的增大而加快。

圖10 初始底物濃度對(duì)產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

2.4.3.6 分批流加

考慮到初始底物濃度過(guò)大會(huì)有相當(dāng)長(zhǎng)的抑制期，而初始底物濃度過(guò)小時(shí)，產(chǎn)物積累量又較少，采用分批流加的方式來(lái)生產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸，結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 分批流加生產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸

由圖11可知，采用流加方式，相比一開(kāi)始就加高濃度的底物，積累5-甲基吡嗪-2-羧酸的速率可以一直保持在3.80 mg·h-1以上，反應(yīng)528 h時(shí)取樣，產(chǎn)物濃度達(dá)20.41 g·L-1，產(chǎn)率達(dá)到75.6%。

3 結(jié)論

從土壤中篩選得到一株可以選擇性氧化2,5-二甲基吡嗪生成5-甲基吡嗪-2-羧酸的產(chǎn)單加氧酶菌株ZJB-LLJ，經(jīng)過(guò)生理生化鑒定及16S rDNA序列分析確定為惡臭假單胞菌。并對(duì)其轉(zhuǎn)化2,5-二甲基吡嗪產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在500 mL搖瓶中裝液100 mL、溫度為30 ℃、pH值為7～8、以對(duì)二甲苯為唯一碳源、誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后添加底物的條件下，產(chǎn)物積累量最大；采用分批流加的方式積累產(chǎn)物較快，轉(zhuǎn)化528 h后5-甲基吡嗪-2-羧酸濃度達(dá)20.41 g·L-1，產(chǎn)率達(dá)到75.6%。菌株ZJB-LLJ可以有效地將2,5-二甲基吡嗪氧化成5-甲基吡嗪-2-羧酸，具有區(qū)域選擇性高、反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率較高等優(yōu)點(diǎn)，如經(jīng)過(guò)進(jìn)一步發(fā)酵罐優(yōu)化后，有望達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求。

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