張洪峰，彭 軍

(中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南長沙 410078)

肌球蛋白是一超家族蛋白質(zhì)，目前至少發(fā)現(xiàn)了25種，它們的結(jié)構(gòu)和功能各不相同。研究最多的是肌球蛋白Ⅱ，它和肌動蛋白一起構(gòu)成了心肌、骨骼肌和平滑肌的主要收縮蛋白。非肌肉細胞中也存在肌球蛋白 Ⅱ，稱為非肌肉肌球蛋白Ⅱ(non-muscle myosinⅡ，NMⅡ)。作為一種分子馬達(molecular motor)，NMⅡ通過與ATP水解偶聯(lián)，為細胞中各種成分的運動及分子間的相互作用提供動力。近年研究表明，NMⅡ除了為細胞內(nèi)分子運動提供動力外，也參與了細胞的各種生理活動，如細胞遷移、黏附、胞質(zhì)分裂、囊泡轉(zhuǎn)移、細胞吞飲和基因轉(zhuǎn)錄等。

1 NMⅡ的生物學(xué)特性

1.1 NMⅡ結(jié)構(gòu)與功能 像肌肉中肌球蛋白一樣，NMⅡ是由3對多肽組成:兩條分子量為230 ku的重鏈(NMHC)，兩條20 ku的調(diào)節(jié)輕鏈(MLC20)和兩條17 ku的必需輕鏈(MLC17)。根據(jù)NMHC不同可將NM Ⅱ分為NM Ⅱ-A、B、C 3個亞型。在人類它們分別被3個不同的基因——肌球蛋白重鏈(MYH)9、MYH 10和 MYH 14編碼［2］。用胰蛋白酶處理肌球蛋白分子，可產(chǎn)生帶有兩個頭部和足夠長度桿部的區(qū)段稱為重酶解肌球蛋白(HMM)。HMM經(jīng)木瓜蛋白酶處理，形成肌球蛋白頭部(S1)和桿部(Fig 1)。NMⅡ具有多種功能:在氨基端的2個球狀馬達區(qū)域能與肌動蛋白結(jié)合并水解MgATP;桿狀螺旋區(qū)域?qū)拥鞍捉z的組裝有重要作用;在非螺旋尾部(non-helical tail，NHT)，不同NM Ⅱ亞型中氨基酸序列也不同，包含很多可被PKC和酪氨酸激酶磷酸化位點。

Fig 1 Schematic diagram for the structure of non-muscle myosinⅡ

1.2 NMⅡ的活性調(diào)節(jié) NMⅡ有兩個磷酸化區(qū)域:MLC20和NMHC。激活NMⅡ過程中重要的一步就是MLC20位點Ser19的磷酸化，Ser19的磷酸化影響MgATPase的活性和肌動蛋白絲的組裝，MLC20位點Thr18磷酸化水平升高會進一步增強MgATPase的活性。去磷酸化的NMⅡ會通過分子頭部和尾部的相互作用折疊成緊湊的結(jié)構(gòu)，阻斷肌球蛋白絲的組裝。許多激酶如肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)、Rho激酶(ROCK)、Zipper相互作用蛋白激酶(ZIPK)等可通過磷酸化激活MLC20。在NMHC的羧基端的螺旋區(qū)段和非螺旋的尾部也存在磷酸化位點，這些位點可被CKⅡ、TRPM7和PKC等激酶磷酸化。CKⅡ能作用NMHC非螺旋尾部的Ser1943位點，而TRPM7則能磷酸化NMⅡB和NMⅡC螺旋區(qū)域和非螺旋尾部的位點［3－4］。

2 NMⅡ與細胞遷移

NMⅡ?qū)︷ぶ叩纳L分布、細胞偽足的形成和微管的穩(wěn)定性有重要作用。分別用低濃度的NMⅡATP酶抑制劑blebbistatin和NMⅡ激活劑calyculin A處理細胞，發(fā)現(xiàn)這些處理并不改變NMⅡ的分布，而是影響NMⅡ的活動。被blebbistatin處理過的細胞比正常細胞形成更小的、致密度低的黏著斑，而被calyculin A處理的細胞卻發(fā)現(xiàn)更大的、更致密的黏著斑，提示增加NMⅡ的收縮能力可以促進黏著斑的生長和分布［5］。有NMⅡ-A缺陷的細胞會阻礙黏著斑的形成、細胞收縮、應(yīng)力纖維組織和細胞尾部的回縮。這種缺陷細胞的無定向遷移速度增加了2～3倍，呈現(xiàn)異常大的板狀偽足，伴隨廣泛無極性的細胞起皺，這是由于NMⅡ-A的缺失增強了微管在細胞邊緣偽足中的聚集，使膜廣泛起皺和移動速度增加，說明NMⅡ-A能調(diào)節(jié)細胞收縮并維持微管和肌動球蛋白間的平衡，負性調(diào)節(jié)膜起皺和細胞的移動［6］。對細胞遷移能力和突起伸展的負性調(diào)節(jié)現(xiàn)象同樣也存在NMⅡ-B 缺失的細胞［7］。

NMⅡ在腫瘤細胞浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。溶血磷脂酸(LPA)與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Kim等［8］證實LPA可激活LPA1受體，該受體可促進MLC20磷酸化導(dǎo)致腫瘤細胞的遷移。LPA誘導(dǎo)的腫瘤細胞的遷移可被blebbistatin或沉默NMⅡ的表達所抑制，增加NMⅡ的表達則恢復(fù)細胞的遷移能力。P-鈣黏蛋白在黑色素瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，抑制NMⅡ-B活性也可促進P-鈣黏蛋白對黑色素瘤的轉(zhuǎn)移的抑制作用［9］。

3 NMⅡ與細胞黏附

NMⅡ可通過調(diào)節(jié)鈣黏素參與上皮細胞黏附、細胞連接等。NMⅡ?qū)︹}黏素定位和聚集必需的。Shewan等［10］在Mcf7乳腺癌細胞和中國倉鼠卵巢細胞證明NMⅡ和鈣黏素存在相互作用，這種作用被NMⅡ活性抑制劑減弱，在有E-鈣黏素的細胞連接里發(fā)現(xiàn)存在NMⅡ，它的募集需要E-鈣黏素的活性。用blebbistatin或ML-7抑制NMⅡ的活性，會很快削弱細胞連接處聚集E-鈣黏素的能力，伴有細胞黏附能力下降。Conti等［11］將小鼠胚胎干細胞中的NMⅡ-A剔除后，發(fā)現(xiàn)細胞間黏附缺失，小鼠在E6.5之前不能發(fā)育成正常內(nèi)臟內(nèi)胚層，并在E7.5死亡，這可能是由于E-鈣黏素和β-連環(huán)蛋白不能夠募集到細胞黏附位點引起的。

Miyake等［12］發(fā)現(xiàn)ROCK和NM Ⅱ ATPase抑制劑阻斷細胞黏著連接組分的聚集。剔除NMⅡ-B的基因會導(dǎo)致胚胎發(fā)育中神經(jīng)上皮細胞黏附缺陷，有趣的是，這種缺陷可部分被馬達蛋白受損的NMⅡ-B蛋白修復(fù)，提示NMⅡ-B在調(diào)控AJC的形成時主要起到結(jié)構(gòu)性的作用［13］。新近發(fā)現(xiàn)幽門螺旋桿菌導(dǎo)致的胃黏膜屏障減弱與胃上皮細胞的NMⅡ活性有關(guān)，幽門螺旋桿菌感染可提高MLCK活性和促進MLC的磷酸化，使胃黏膜上皮細胞的緊密連接調(diào)節(jié)異常［14］。

4 NMⅡ與胞質(zhì)分裂

NMⅡ影響紡錘絲的組裝、定位。Blebbistatin或 Y-27362處理后，NMⅡ活性受到抑制，細胞染色體的分離被阻斷，且紡錘體組裝和定位受到干擾［15］。Matson等［16］首次證實在減數(shù)分裂的細胞中，MLCK抑制劑ML-7通過阻止紡錘體的旋轉(zhuǎn)和收縮環(huán)的形成呈劑量依賴的抑制第二極體的形成。NMⅡ可影響胞質(zhì)分裂時分裂溝的收縮。Blebbistatin可抑制分裂溝的收縮而不影響細胞分裂和收縮環(huán)的組裝［17］。磷酸化的MLC20可促進NM Ⅱ的ATPase活性和NMⅡ的組裝，MLC20去磷酸化后，HeLa細胞分裂減緩，這種現(xiàn)象可以被MLC20磷酸化逆轉(zhuǎn)。在參與胞質(zhì)分裂的調(diào)節(jié)中，NMⅡ各個亞型的作用不同。缺乏NMⅡ-B的心肌細胞許多呈現(xiàn)多核，提示它們有細胞分裂缺陷，補充NMⅡ-A并不能改變這一現(xiàn)象。在人肺癌細胞系A(chǔ)549，用特異性siRNA干擾NMⅡ-C1的表達會使細胞數(shù)量急劇減少、分裂明顯延遲，而抑制NMⅡ-B卻不影響細胞的增殖，這種抑制作用可通過補充NMⅡ-C1(而非NM Ⅱ-B或Ⅱ-A)來挽救。Wu等［18］首次證明癌細胞的胞質(zhì)分裂缺陷是由于MLC磷酸化障礙造成的，降低MLC磷酸化水平會導(dǎo)致癌細胞胞質(zhì)分裂缺陷，而增加MLC磷酸化水平則可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。

5 NMⅡ其它功能

NMⅡ?qū)δ遗莸霓D(zhuǎn)移和釋放、細胞吞飲、病毒入侵等方面有重要作用。Seabrooke等［19］發(fā)現(xiàn)在突觸前膜和突觸后膜存在NMⅡ，當用ML-9抑制NMⅡ的活性時，囊泡的移動能力呈劑量依賴性遞減，提示NMⅡ參與了囊泡移動。當用blebbistatin或ML-7處理嗜鉻細胞時，細胞膜附近的嗜鉻粒的移動和釋放頻率都降低，說明NMⅡ參與嗜鉻粒釋放兒茶酚胺［20－21］。同樣，NM Ⅱ活性受到抑制時，自然殺傷(NK)細胞的裂解性顆粒釋放減弱，不能與靶細胞膜融合［22］。除了調(diào)節(jié)突觸囊泡與突觸后膜的融合外，NMⅡ還可調(diào)節(jié)囊泡與后膜“kiss-and-run”的接觸過程，通過融合孔和后膜連接來釋放遞質(zhì)。當神經(jīng)內(nèi)分泌細胞過表達正常的NMⅡ的調(diào)節(jié)輕鏈時，與對照比較，融合孔的開放時間延長，神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多，推測NMⅡ可通過調(diào)節(jié)融合孔開放時間來控制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量［23］。Megalin是腎小球濾過過程中蛋白重吸收受體，最近發(fā)現(xiàn)NM-ⅡA參與megalin介導(dǎo)的蛋白內(nèi)吞作用［24］。NMⅡ還在細胞自噬中扮演重要角色，MLC磷酸化可促進細胞的自噬作用，敲除或抑制NMⅡ可使饑餓下細胞自噬小體的形成受阻［25］。NM-ⅡA通過與膜糖蛋白B(gB)相互作用來充當單純性皰疹病毒(HSV-1)侵入細胞的受體。針對NM-ⅡA的抗體或NM-ⅡA基因敲除可阻斷HSV-1對宿主細胞的的感染和細胞融合。而且在HSV-1入侵的初始階段，宿主細胞表面的 NM-ⅡA被顯著和快速地誘導(dǎo)表達［26］。在結(jié)腸平滑肌細胞中，核肌球蛋白Ⅱ能識別ICAM-1核心啟動子區(qū)域的AGCTCC序列，MLC20的去磷酸化能促進ICAM-1的轉(zhuǎn)錄，反之則下調(diào)ICAM-1的轉(zhuǎn)錄。而且在結(jié)腸炎癥發(fā)生時，核MLCK受抑制，使核MLC20的去磷酸化水平提高，導(dǎo)致ICAM-1轉(zhuǎn)錄的增強［27］。以上都提示核肌球蛋白Ⅱ是一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

6 結(jié)語

目前對NMⅡ的細胞遷移、黏附、胞質(zhì)分裂等方面的研究較透徹，但NMⅡ的其它功能的研究較少。如在介導(dǎo)囊泡轉(zhuǎn)移和釋放方面，主要集中在對神經(jīng)突觸傳遞、嗜鉻細胞和NK細胞等的研究，NMⅡ在其它分泌細胞和吞噬細胞(如垂體、腎上腺、巨噬細胞等)中的作用尚不清楚，囊泡釋放的作用機制亦無定論［20］。肌球蛋白不僅存在胞質(zhì)，也發(fā)現(xiàn)存在細胞核中，已證實核肌球蛋白Ⅱ在特定組織中具有調(diào)節(jié)細胞間黏附因子-1(ICAM-1)轉(zhuǎn)錄功能［27］，但核肌球蛋白Ⅱ在其它細胞或組織調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄尚未闡明。此外，對NMⅡ-B和NMⅡ-C的前mRNA選擇性剪接形成的各種單體的分布和功能也值得我們深入研究。

［1］ Vicente-Manzanares M，Ma X，Adelstein R S，et al.Non-muscle myosin Ⅱ takes centre stage in cell adhesion and migration［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10(11):778 －90.

［2］ Golomb E，Ma X，Jana S S，et al.Identification and characterization of nonmuscle myosinⅡ-C，a new member of the myosinⅡfamily［J］.J Biol Chem，2004，279(4):2800 －8.

［3］ Dulyaninova N G，Malashkevich V N，Almo S C，Bresnick A R.Regulation of myosin-ⅡA assembly and Mts1 binding by heavy chain phosphorylation［J］.Biochemistry，2005，44(18):6867 －76.

［4］ Clark K，Middelbeek J，Dorovkov M V，et al.The alpha-kinases TRPM6 and TRPM7，but not eEF-2 kinase，phosphorylate the assembly domain of myosin ⅡA，ⅡB and ⅡC［J］.Febs Lett，2008，582(20):2993－7.

［5］ Gupton S L，Waterman-Storer C M.Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration［J］.Cell，2006，125(7):1361 － 74.

［6］ Even-Ram S，Doyle A D，Conti M A，et al.Myosin ⅡA regulates cell motility and actomyosin-microtubule crosstalk［J］.Nat Cell Biol，2007，9(3):299 －309.

［7］ Betapudi V，Licate L S，Egelhoff T T.Distinct roles of nonmuscle myosinⅡisoforms in the regulation of MDA-MB-231 breast cancer cell spreading and migration［J］.Cancer Res，2006，66(9):4725－33.

［8］ Kim J H，Adelstein R S.LPA(1)-induced migration requires nonmuscle myosinⅡlight chain phosphorylation in breast cancer cells［J］.J Cell Physiol，2011，226(11):2881 －93.

［9］ Jacobs K，Van Gele M，F(xiàn)orsyth R，et al.P-cadherin counteracts myosin Ⅱ-B function:implications in melanoma progression［J］.Mol Cancer，2010，9:255.

［10］Shewan A M，Maddugoda M，Kraemer A，et al.Myosin 2 is a key Rho kinase target necessary for the local concentration of E-cadherin at cell-cell contacts［J］.Mol Biol Cell，2005，16(10):4531 －42.

［11］Conti M A，Even-Ram S，Liu C，et al.Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain Ⅱ-A in mice［J］.J Biol Chem，2004，279(40):41263－66.

［12］Miyake Y，Inoue N，Nishimura K，et al.Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation［J］.Exp Cell Res，2006，312(9):1637－50.

［13］Ma X，Bao J，Adelstein R S.Loss of cell adhesion causes hydrocephalus in nonmuscle myosinⅡ-B-ablated and mutated mice［J］.Mol Biol Cell，2007，18(6):2305 －12.

［14］Wroblewski L E，Shen L，Ogden S，et al.Helicobacter pylori dysregulation of gastric epithelial tight junctions by urease-mediated myosin Ⅱ activation［J］.Gastroenterology，2009，136(1):236 －46.

［15］Rosenblatt J，Cramer L P，Baum B，et al.Myosin Ⅱ-dependent cortical movement is required for centrosome separation and positioning during mitotic spindle assembly［J］.Cell，2004，117(3):361－72.

［16］Matson S，Markoulaki S，Ducibella T.Antagonists of myosin light chain kinase and of myosinⅡinhibit specific events of egg activation in fertilized mouse eggs［J］.Biol Reprod，2006，74(1):169 －76.

［17］Straight A F，Cheung A，Limouze J，et al.Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin Ⅱ Inhibitor［J］.Science，2003，299(5613):1743 －7.

［18］Wu Q，Sahasrabudhe R M，Luo L Z，et al.Deficiency in myosin light-chain phosphorylation causes cytokinesis failure and multipolarity in cancer cells［J］.Oncogene，2010，29(29):4183 －93.

［19］Seabrooke S，Qiu X，Stewart B A.Nonmuscle myosin Ⅱ helps regulate synaptic vesicle mobility at the Drosophila neuromuscular junction［J］.BMC Neurosci，2010，11:37.

［20］Berberian K，Torres A J，F(xiàn)ang Q，et al.F-actin and myosin Ⅱ accelerate catecholamine release from chromaffin granules［J］.J Neurosci，2009，29(3):863 － 70.

［21］Doreian B W，F(xiàn)ulop T G，Smith C B.MyosinⅡ activation and actin reorganization regulate the mode of quantal exocytosis in mouse adrenal chromaffin cells［J］.J Neurosci，2008，28(17):4470 －78.

［22］Andzelm M M，Chen X，Krzewski K，et al.Myosin ⅡA is required for cytolytic granule exocytosis in human NK cells［J］.J Exp Med，2007，204(10):2285 －91.

［23］Aoki R，Kitaguchi T，Oya M，et al.Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosinⅡduring kiss-and-run exocytosis［J］.Biochem J，2010，429(3):497－504.

［24］Hosaka K，Takeda T，Iino N，et al.Megalin and nonmuscle myosin heavy chainⅡA interact with the adaptor protein Disabled-2 in proximal tubule cells［J］.Kidney Int，2009，75(12):1308 － 15.

［25］Tang H W，Wang Y B，Wang S L，et al.Atg1-mediated myosin Ⅱactivation regulates autophagosome formation during starvation-induced autophagy［J］.Embo J，2011，30(4):636 －51.

［26］Arii J，Goto H，Suenaga T，et al.Non-muscle myosin ⅡA is a functional entry receptor for herpes simplex virus-1［J］.Nature，2010，467(7317):859－62.

［27］Li Q，Sarna S K.Nuclear myosin Ⅱ regulates the assembly of preinitiation complex for ICAM-1 gene transcription［J］.Gastroenterology，2009，137(3):1051 －60.