姜月華，孫敬昌，周洪雷，王永瑞，李運倫

(1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東濟南 250011;2.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南 250355)

鉤藤堿(rhynchophylline)和異鉤藤堿(isorhynchophylline)是從中藥材鉤藤中分離、提純的生物堿，是鉤藤發(fā)揮降壓效應的主要成分。前期研究表明鉤藤堿和異鉤藤堿能降低自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rats，SHR)胸主動脈和腸系膜動脈中膜厚度/管腔直徑比值，改善胸主動脈和腸系膜動脈病理組織學損害［1］，調控SHR胸主動脈平滑肌細胞的凋亡，抑制胸主動脈平滑肌細胞的增殖［2－3］，但鉤藤堿和異鉤藤堿能否抑制SHR動脈壁膠原的沉積及作用機制尚不清楚。本文研究鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿(Uncaria alkaloids)對SHR胸主動脈Ⅰ型膠原(Collagen typeⅠ，ColⅠ)和Ⅲ型膠原(CollagentypeⅢ，ColⅢ)的影響，并進一步觀察其對動脈壁基質金屬蛋白酶(marix metalloproteinase，MMP)-9、MMP-2以及其組織抑制因子(tissue inhititor of metalloproteinase，TIMP)-2 的作用，探討其可能存在的抗高血壓動脈膠原重塑的機制，從而為鉤藤生物堿的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ♂SHR 40只，8周齡，體質量192～217 g，由北京維通利華實驗動物中心提供［許可證:SCXK(京)2006-0009］;♂Wistar大鼠8只，8周齡，體質量196～220 g，山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供［許可證:SCXL(魯)20051015］。

1.2 試劑與材料 鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿:由山東中醫(yī)藥大學藥學院周洪雷教授提供，純度分別為0.997、0.997 和 0.80，用前經 0.1 mol·L－1HCl溶解后，分別用蒸餾水稀釋為0.5、0.5和5 g·L－1，調pH至7.2。置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们罢袷?，充分搖勻。卡托普利(captopril):濟南東風制藥有限公司，魯藥準字(2001)第027510號，生產批號0208023，25 mg/片。實驗前加適量生理鹽水，配制成1.75 g·L－1的混懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。即用型SABC免疫組化染色檢測試劑盒、ColⅠ兔多抗IgG、ColⅠmRNA原位雜交檢測試劑盒、ColⅢ兔多抗IgG、ColⅢ mRNA原位雜交檢測試劑盒、DAB顯色劑、生物素化山羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司。MMP-9鼠單抗 IgG、MMP-2鼠單抗 IgG、TIMP-2鼠單抗IgG、MMP-9原位雜交檢測試劑盒、TIMP-2原位雜交檢測試劑盒，北京中杉金橋生物制品有限公司產品。

1.3 動物分組給藥 將SHR隨機分為5組:模型組、卡托普利組、異鉤藤堿組、鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組。Wistar大鼠8只作為正常組。卡托普利組給藥量為每天17.5 mg·kg－1，異鉤藤堿組、鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組的給藥量分別為每天5、5和50 mg·kg－1，模型組和正常組給予等容量生理鹽水。給藥容積為每次10 ml·kg－1，灌胃給藥，每周給藥6 d，每天下午定時給藥，連續(xù)8周，并隨體質量變化調整給藥量。

1.4 動脈留取 末次用藥24 h后，禁食12 h(不禁水)，用質量濃度為0.02 g·L－1的戊巴比妥鈉2 ml·kg－1體重腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血。取血后立即從頸靜脈穿刺插管，用4℃生理鹽水約50 ml快速灌注沖洗，待沖洗液無色后，快速分離、摘取胸主動脈，分為2份:一份用體積分數(shù)為0.1的甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測;一份用體積分數(shù)為0.04的多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于原位雜交檢測。

1.5 胸主動脈膠原的定性檢測 采用Masson染色法。

1.6 胸主動脈 ColⅠ、ColⅢ、MMP-9、MMP-2 和TIMP-2的蛋白表達檢測 采用免疫組織化學SABC法:石蠟切片脫蠟至水，體積分數(shù)為0.03的H2O2室溫10 min，PBS洗5 min×3次，微波修復抗原，體積分數(shù)為0.05的BSA封閉20 min，滴加親和純化ColⅠ兔多抗IgG或ColⅢ兔多抗IgG或MMP-9鼠單抗IgG或TIMP-2鼠單抗IgG(1∶100倍稀釋)，濕盒內37℃ 1 h，PBS代替一抗作為陰性對照，PBS洗2 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔 IgG，37℃20 min，PBS洗 2 min ×3 次，滴加試劑 SABC，37℃20 min，PBS洗5 min×4次，DAB顯色，鏡下控制時間，蒸餾水洗滌，脫水，透明，中性樹膠封片。任選5個視野用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件對結果進行半定量分析，測定平均灰度，以均值作為該樣本ColⅠ、ColⅢ、MMP-9和 TIMP-2的相對表達量。

1.7 胸主動脈 ColⅠ、ColⅢ、MMP-9和 TIMP-2的mRNA表達檢測 采用原位雜交法，嚴格按照試劑盒說明進行操作。并用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件對結果進行半定量分析，測定平均灰度，以此作為該樣本 ColⅠ、ColⅢ、MMP-9和 TIMP-2的mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 各組胸主動脈和腎動脈膠原含量的定性檢測在Masson染色下膠原纖維呈綠色。正常組大鼠胸主動脈、腎動脈壁存在膠原纖維表達，而SHR模型組大鼠胸主動脈、腎動脈壁膠原纖維表達較強，綠色表現(xiàn)較重。與模型組比較，各用藥組胸主動脈、腎動脈壁膠原纖維表達均有不同程度的減輕，綠色表現(xiàn)有不同程度變淺。見Fig 1。

Fig 1 Masson staining of thoracic aorta

2.2 各組胸主動脈ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達檢測如Tab 1示，與模型組相比，鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組大鼠胸主動脈Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的蛋白質表達、mRNA表達均降低(P＜0.05)。

2.3 各組胸主動脈MMP-9、MMP-2、TIMP-2蛋白表達的比較 如Tab 2示，與模型組相比，鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組大鼠胸主動脈MMP-9和MMP-2蛋白質表達均升高(P＜0.01)，而TIMP-2蛋白質表達均降低(P＜0.05)。與模型組相比，大鼠胸主動脈鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組MMP-9 mRNA表達均升高(P＜0.01～0.05)，而TIMP-2 mRNA表達均降低(P＜0.05)。

3 討論

膠原在人類和動物血管組織中普遍存在，是血管壁細胞外基質的主要成分，占細胞外基質含量0.8～0.9，其中又以Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原為主。膠原除了作為血管壁的支撐材料外，還可以影響血管壁的組織結構。在高血壓的病理進程中，大動脈壁膠原的合成與降解相伴行，正由于大動脈壁膠原過度合成、降解不足、合成與降解之間的動態(tài)平衡被打破，導致大動脈壁膠原異常沉積［4－5］。因此，促進大動脈壁膠原降解，抑制大動脈壁膠原合成不僅是抗大動脈壁膠原沉積的基本策略，同時也是抗高血壓血管重塑的重要目標。

Tab 1ColⅠand ColⅢprotein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

Tab 1ColⅠand ColⅢprotein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

?

Tab 2MMP-9 and TIMP-2 protein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

Tab 2MMP-9 and TIMP-2 protein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

?

自發(fā)性高血壓大鼠是篩選抗高血壓藥物最適宜的動物模型，且出現(xiàn)血管周圍間質膠原纖維明顯增生、血管中膜增厚、管壁厚度增加、彈性纖維板部分斷裂等大動脈硬化的表現(xiàn)［6－7］，故本實驗以SHR胸主動脈作為高血壓大動脈膠原沉積模型，探討鉤藤生物堿在降低血壓的同時對SHR胸主動脈膠原沉積的影響，分析Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達的特征。結果顯示SHR胸主動脈存在膠原沉積、胸主動脈ColⅠ、ColⅢ蛋白表達及 ColⅠmRNA、ColⅢ mRNA轉錄增多，經鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿干預，SHR胸主動脈膠原沉積減輕，胸主動脈ColⅠ、ColⅢ蛋白表達及ColⅠmRNA、ColⅢ mRNA轉錄均降低，表明鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿有抑制SHR胸主動脈的膠原沉積的效應，其機制與下調SHR胸主動脈壁ColⅠ、ColⅢ蛋白和mRNA的表達有關。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組依賴Zn2+并以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分為水解底物的蛋白水解酶，MMPs通過對ECM成分的水解，影響其水解與重組的動態(tài)平衡，MMP-2和MMP-9是MMPs的重要成員;MMPs的組織抑制因子(tissue inhibitors of the matrix metalloproteinases，TIMPs)是MMPs的天然抑制劑，TIMP-2是TIMPs家族的重要成員。在病理狀態(tài)下，TIMPs水平改變直接影響MMPs活性的高低。MMPs及其抑制劑TIMPs調控細胞外基質的代謝，兩者的動態(tài)平衡維持血管的正常形態(tài)和功能，動脈壁MMP-9和MMP-2異常表達參與了高血壓病早期血管重塑的病理進程［8－14］。本實驗發(fā)現(xiàn)，在SHR胸主動脈存在MMP-9和MMP-2蛋白和mRNA低表達、TIMP-2蛋白和TIMP-2 mRNA高表達現(xiàn)象，經鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿干預后，SHR胸主動脈MMP-9和MMP-2蛋白和mRNA表達上調，TIMP-2蛋白和mRNA表達下調。從而表明鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿可通過上調MMP-9和 MMP-2蛋白和 mRNA表達、下調TIMP-2蛋白和mRNA表達來抑制SHR胸主動脈膠原沉積效應。

綜上所述，鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿對SHR胸主動脈膠原沉積具有抑制作用，其機制與下調SHR胸主動脈壁ColⅠ、ColⅢ蛋白和mRNA表達有關，更深入的機制與上調MMP-9蛋白和mRNA表達、上調MMP-2蛋白表達、下調TIMP-2蛋白和mRNA表達有關，體現(xiàn)了中藥多途徑、多靶點及整體調節(jié)的優(yōu)勢，從而可以推斷鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿對防治高血壓大動脈硬化的發(fā)生發(fā)展具有積極的意義。至于鉤藤生物堿抑制膠原沉積的機制是降低血壓繼發(fā)的膠原抑制效應還是獨立于降壓效應之外的靶向性膠原抑制效應抑或是二者兼有，尚有待于進一步探討。

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