鄧華菲，何漢江

(湘南學院病理生理學教研室，湖南郴州 423000)

血管內(nèi)皮細胞不僅是保護血管形態(tài)和功能的一層天然屏障，還能分泌一些血管活性物質，如一氧化氮(nitric oxide，NO)、內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ等。大量研究表明［1－3］，NO介導的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的損傷是許多心血管疾病如動脈粥樣硬化、高血壓及糖尿病血管并發(fā)癥的共同病理基礎。已知氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4］。溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)是ox-LDL的主要成分，也是ox-LDL損傷血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的主要脂質成分［5］。用LPC體外孵育正常血管也能模擬ox-LDL對血管內(nèi)皮依賴性舒張的損傷作用［6］。因此，阻止LPC對血管內(nèi)皮的損害是防治動脈粥樣硬化的一條有效途徑。

依達拉奉(edaravone，Eda)是一種新型的自由基清除劑，主要用于腦缺血的治療。新近研究表明Eda能對抗異丙腎上腺素對心肌細胞的損傷作用［7］。Takaaki Okabe 等［8］發(fā)現(xiàn) Eda 能抑制載脂蛋白-E缺乏小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。徐向輝等［9］研究發(fā)現(xiàn)Eda預處理能降低腦缺血/再灌注對大鼠血管內(nèi)皮功能的損傷。但Eda能否改善LPC誘導的血管內(nèi)皮損傷尚不清楚。因此，本實驗用LPC體外孵育兔胸主動脈環(huán)誘導血管內(nèi)皮損傷，探討Eda對LPC損傷血管內(nèi)皮的作用及機制，為Eda用于防治心血管疾病提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 Eda購自南京先聲藥業(yè)有限公司，批號80-091215。溶血磷脂酰膽堿、苯腎上腺素、硝普鈉購自Sigma公司。乙酰膽堿(ACh)購自上海三愛思試劑有限公司。丙二醛(malonaldehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。BCA蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。

1.2 實驗動物 實驗用家兔，體質量1.5～2.2 kg，♀♂各半，每組5只。由湘南學院動物學部提供。

1.3 實驗儀器 Pclab-UE生物醫(yī)學信號采集處理系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，張力換能器(北京微信斯達科技發(fā)展有限責任公司)。低溫離心機(美國Beckman公司)，熒光分光光度計(日本Hitachi公司)，UV755B分光光度計(上海分析儀器總廠)

1.4 離體血管舒張功能檢測 將家兔用戊巴比妥鈉麻醉(40 mg·kg－1)，分離胸主動脈置于 4℃Krebs-Henseleit(K-H)緩沖液(成分:NaCl 118.3，KCl 4.7，CaCl22.5，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325.0，Glucose 11.0 mmol·L－1)中。小心剔除血管周圍脂肪和結締組織，盡量避免損傷血管內(nèi)皮。截取3～4 mm的血管環(huán)懸掛于兩個不銹鋼掛鉤上，一端固定于器官浴槽，另一端連接張力換能器，用Pclab-UE生物醫(yī)學信號采集處理系統(tǒng)記錄血管張力變化。血管環(huán)置于盛有5 ml克氏液的器官浴槽中(37℃恒溫)，并持續(xù)充以95%O2和5%CO2的混合氣體，加靜息張力6 g，每隔15 min更換浴槽中的克氏液1次，平衡90 min。血管環(huán)先用60 mmol·L－1KCl使血管環(huán)平滑肌去極化，重復2～3次至血管環(huán)收縮達坪值;沖洗后重新平衡血管環(huán)，再用0.1 μmol·L－1苯腎上腺素預收縮血管，待張力上升并穩(wěn)定后，加入 0.03 ～3 μmol·L－1累積濃度的乙酰膽堿舒張血管，計算不同濃度ACh誘導的血管舒張值占苯腎上腺素引起的最大收縮值的百分數(shù)表示血管環(huán)的舒張百分比。最大舒張反應大于80%的血管環(huán)被認為內(nèi)皮完整，可用于實驗。

1.5 實驗分組 實驗分為4大組，即正常對照組:血管環(huán)用克氏液平衡45 min;LPC損傷組:用5 mg·L－1的LPC孵育家兔胸主動脈環(huán)30 min;Eda+LPC 組:分別用25、50 和100 μmol·L－1的 Eda 預處理胸主動脈環(huán)15 min后，加入5 mg·L－1的LPC共同孵育 30 min。Eda 單獨處理組:100 μmol·L－1的Eda單獨孵育胸主動脈環(huán)45 min。血管環(huán)經(jīng)上述處理后，再加入 0.1 μmol·L－1苯腎上腺素預收縮血管并加入累積濃度的ACh再次檢測內(nèi)皮依賴性舒張反應。實驗結束前，檢測血管環(huán)對10 μmol·L－1硝普鈉誘導的內(nèi)皮非依賴性舒張反應，并計算各種濃度ACh和10 μmol·L－1硝普鈉誘導血管舒張的百分比。

1.6 血管組織中NO和MDA含量及SOD活性的測定 血管環(huán)舒張功能檢測完成后，將血管環(huán)快速保存于－70℃超低溫冰箱中待檢測。解凍血管環(huán)，用濾紙吸干水份，稱重，用小手術剪將其剪碎，加入預冷的生理鹽水;在冰浴上用勻漿器制成10%的組織勻漿，4℃離心10 min后，取上清液，按試劑盒說明和相關要求操作，檢測血管組織中NO、MDA含量及SOD活性，并用BCA蛋白定量試劑盒檢測血管組織中蛋白含量，計算單位蛋白中所含NO、MDA及SOD。

2 結果

2.1 Eda對LPC抑制兔血管內(nèi)皮依賴性舒張的作用 經(jīng)上述藥物處理后，各組血管環(huán)對0.1 μmol·L－1苯腎上腺素均能產(chǎn)生相似的收縮反應(數(shù)據(jù)未顯示)，當收縮達坪值后，加入累積濃度的ACh可誘導正常對照組血管環(huán)產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性和劑量依賴性的舒張反應;而用5 mg·L－1LPC孵育離體胸主動脈30 min后，明顯地降低了ACh誘導的內(nèi)皮依賴性舒張反應(Fig 1)。但未影響其非內(nèi)皮依賴性舒張反應(數(shù)據(jù)未顯示)。與正常對照組相比，LPC處理組最大舒張百分比(maximal relaxation rate，Emax)降低而半數(shù)有效濃度(half maximum effective concentration，EC50:指引起最大舒張百分比的50%時所需的 ACh 濃度)升高(Tab 1)。用 25 ～100 μmol·L－1的Eda預孵育兔離體胸主動脈環(huán)15 min，然后與5 mg·L－1的LPC共同孵育血管環(huán)30 min，明顯降低LPC對兔胸主動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張反應的抑制作用;使血管環(huán)對ACh誘導的內(nèi)皮依賴性舒張增加(Fig 1)。與LPC組比較，Eda處理組血管環(huán)的Emax明顯增加而EC50則明顯降低(Tab 1)。與正常對照組相比，Eda單獨處理組沒有改變兔胸主動脈環(huán)的內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性舒張反應(數(shù)據(jù)未顯示)。

Fig 1 Effect of edaravone(Eda)on the impaired endothelium-dependent relaxation of rabbit aortas induced by LPC(±s，n=5)

2.2 Eda對離體血管組織中NO和MDA含量以及SOD活性的影響 與正常對照組相比，LPC處理組血管組織中MDA含量增加，SOD活性下降，NO釋放減少。Eda(25 ～100 μmol·L－1)處理后，MDA含量下降，SOD活性升高，NO釋放增多。與正常對照組比較，Eda單獨處理組MDA含量、SOD活性、NO的釋放無明顯改變(Tab 2)。

Tab 1 Effects of LPC and edaravone(Eda)on the Emaxand EC50values for acetylcholine-induced relaxation of rabbit aortic rings(±s，n=5)

Tab 1 Effects of LPC and edaravone(Eda)on the Emaxand EC50values for acetylcholine-induced relaxation of rabbit aortic rings(±s，n=5)

The maximal relaxation(Emax)response to 3 μmol·L －1acetylcholine(ACh)of rabbit aortic rings is expressed as percentage of contraction elicited by phenylephrine 0.1 μmol·L －1.The half-maximum effective concentration(EC50)response to ACh is calculated by linear regression from log concentration-effect curves of ACh.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs 5 mg·L－1LPC group

Group ACh Emax/% ACh EC50/nmol·L －1 Control 85.12 ±2.83 115.08 ±29.96 LPC 5 mg·L －1 43.55±6.31＊＊ 230.96±40.52＊＊Eda 25 μmol·L －1+LPC 5 mg·L －1 54.93± 5.71## 197.53±33.60 Eda 50 μmol·L －1+LPC 5 mg·L －1 67.83±2.22## 164.84±11.16##Eda 100 μmol·L －1+LPC 5 mg·L －1 82.32±2.14## 130.71±11.20##

Tab 2 Effects of LPC and edaravone(Eda)on the content of NO and MDA and the activity of SOD in isolated vascular tissues(±s，n=5)

Tab 2 Effects of LPC and edaravone(Eda)on the content of NO and MDA and the activity of SOD in isolated vascular tissues(±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 5 mg·L－1LPC group

Group MDA/μmol·g－1 SOD/μU·g－1 NO/μmol·g －1 Control 5.49±0.27 161.45±9.54 4.22±0.31 LPC 5 mg·L－1 6.98±0.44＊＊ 99.21±10.34＊＊ 2.63±0.33＊＊Eda 25 μmol·L －1+LPC 5 mg·L －1 6.29±0.27# 115.76±13.4## 2.84±0.29 Eda 50 μmol·L －1+LPC 5 mg·L －1 5.86±0.43## 133.82±7.16## 3.46±0.24##Eda 100 μmol·L －1+LPC 5 mg·L －1 5.44±0.39## 155.76±7.67## 4.16±0.20##Eda 100 μmol·L － 15.52±0.30 158.59±9.52 4.19±0.22

3 討論

NO介導的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能降低是動脈粥樣硬化的特征性病變。大量動物實驗和臨床研究表明，ox-LDL是動脈粥樣硬化的獨立危險因子，而LPC是ox-LDL產(chǎn)生氧自由基和致血管內(nèi)皮損傷的主要成分［4－5］。在本實驗中我們用 5 mg·L－1LPC孵育家兔離體胸主動脈環(huán)，觀察血管環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張反應、血管組織中NO含量及血管組織中的脂質過氧化代謝產(chǎn)物MDA和氧自由基清除劑SOD的活性。結果顯示，LPC降低了血管內(nèi)皮依賴性舒張反應，但沒有影響非內(nèi)皮依賴性血管舒張反應。這和我們以前在大鼠離體胸主動脈環(huán)［6］、以及其他學者在新西蘭兔胸主動脈［10］和豬冠狀動脈［11］的研究結果相似。LPC降低血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的機制尚不完全清楚。大量研究表明，LPC可以激活蛋白激酶C，促進超氧陰離子的產(chǎn)生［11］，后者使NO氧化滅活增加。此外，LPC還能降低內(nèi)皮細胞一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)mRNA的表達，減少NO合成［5］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)LPC孵育的血管組織中MDA含量升高而NO水平和SOD活性下降。這些結果表明，增加NO滅活和減少NO合成，從而降低NO的生物利用度是LPC導致血管內(nèi)皮依賴性舒張功能降低的主要原因。

Eda的化學名為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，是一種具有捕獲羥自由基活性的自由基清除劑，表現(xiàn)為抗氧化的細胞保護效應，因而最先用于防治腦缺血/再灌注中的氧化損傷，減輕腦水腫，抑制遲發(fā)性神經(jīng)細胞死亡，具有較明顯的神經(jīng)保護功能?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明氧自由基在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中具有十分重要的作用，這為氧自由基清除劑Eda防治動脈粥樣硬化提供了理論依據(jù)。本實驗發(fā)現(xiàn)Eda孵育家兔離體胸主動脈可明顯改善LPC誘導的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的損害，降低了血管組織中MDA的水平和增加了NO含量以及SOD的活性。徐向輝等［9］研究發(fā)現(xiàn)Eda預處理明顯改善大鼠腦缺血/再灌注后血管內(nèi)皮功能，其機制與降低MDA和增加SOD活性有關，周紅杰等［12］報道，Eda降低腦出血大鼠腦組織MDA含量并增加SOD活性;Yoshida等［13］研究發(fā)現(xiàn)Eda能逆轉ox-LDL對eNOS的抑制效應;Jitsuiki等［14］給吸煙者注射依達拉奉后，其前臂血管對ACh的舒張反應增加，應用eNOS抑制劑——N-甲基-L-精氨酸取消了Eda的作用。這些研究表明，Eda具有清除氧自由基及促進內(nèi)皮細胞NO合成的作用，該作用可能與其對抗LPC所致的血管內(nèi)皮功能損害有關。

綜上所述，Eda改善了LPC對血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的損傷，其機制可能與其清除LPC產(chǎn)生的氧自由基，增加NO的生物利用度等抗氧化特性有關。

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