李明勇，黃培春

(廣東醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東湛江 524023)

芹菜素(apigenin，AP)是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，具有多方面的藥理作用，如抗炎［1］、抗氧化［2］和抗腫瘤等作用。其中，以抗腫瘤作用最為突出。實(shí)驗(yàn)證明芹菜素有抑制肺癌A549細(xì)胞［3］、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞［4］、結(jié)腸癌 HT-29 細(xì)胞［5］和前列腺癌 PC-3 細(xì)胞［6］等的增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲以及放化療增敏的作用，且具有低毒、無誘變性等特點(diǎn)［7－8］。本實(shí)驗(yàn)擬觀察AP、順鉑(DDP)單用和合用對體外培養(yǎng)的人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞生長的抑制作用，并用中效原理分析兩種藥物的協(xié)同效應(yīng)，初步探討其促進(jìn)凋亡及抑制增殖的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞由廣東醫(yī)學(xué)院病生教研室提供。在5%CO2，37℃條件下，用含10%小牛血清、青霉素1×105U·L－1，鏈霉素100 mg·L－1的RMPI1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2 主要試劑與藥物 RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;小牛血清為四季青公司產(chǎn)品;MTT和DMSO均為AMRESCO公司產(chǎn)品;PI/Hoechst33258為Sigma公司產(chǎn)品;TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司);其余試劑均為分析純。芹菜素(AP)為Sigma公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)前用DMSO溶解，培養(yǎng)液稀釋，DMSO終濃度為 0.1%(實(shí)驗(yàn)證明該濃度對細(xì)胞無影響 );DDP為南京制藥廠有限公司產(chǎn)品(批號:20110102)。

1.3 方法

1.3.1 采用MTT法分別檢測AP和DDP兩藥單用和合用的效應(yīng) 將生長良好的CNE-2Z細(xì)胞以1×104個/孔180 μl接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、AP單用組、DDP單用組和AP與DDP合用組，每種情況設(shè)3個平行孔，重復(fù)3次，取其平均值。將兩種單藥的5個不同濃度分別加在96 孔板內(nèi)，每孔加藥量 20 μl，AP 終濃度為 10、20、40、80、160 μmol·L－1，DDP 終濃度為 5、10、20、40、80 μmol·L－1;兩藥合用比例為1 ∶1，每孔加藥總量仍為20 μl(每種單藥劑量濃縮至1/2，各加10 μl);空白對照組以RPMI 1640培養(yǎng)液補(bǔ)足，每孔總體系200 μl。培養(yǎng)48 h 后每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加DMSO 200 μl置搖床低速混勻15 min，自動酶標(biāo)讀數(shù)儀比色波長570 nm測出吸光度值(A值)，并計算藥物對CNE-2Z細(xì)胞的增殖抑制率(fa)，計算公式為細(xì)胞增殖抑制率(fa)/%=(1－實(shí)驗(yàn)組A值均數(shù)/對照組A值均數(shù))×100%。

結(jié)果判定方法:參考文獻(xiàn)［9］，兩藥單用及合用的中效濃度(IC50)通過Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法計算，中效方程式為:fa/fu=(D/Dm)m求得(式中fa為效應(yīng)，fu=1－fa，D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m為中效曲線斜率)。

兩藥合用在不同效應(yīng)的聯(lián)合指數(shù)(CI)的計算公式為:CI=(D1/Dx1)+(D2/Dx2)+α(D1D2/Dx1Dx2)。Dx1、Dx2為兩藥單用時產(chǎn)生x效應(yīng)的各自所需濃度，兩藥合用時產(chǎn)生x效應(yīng)所需濃度為Dx(1，2)，均可由中效方程式:fa/fu=(D/Dm)m求得。D1、D2為合用時產(chǎn)生x效應(yīng)時兩藥各自所需濃度，可由公式D1+D2=Dx(1，2)求出。兩種作用機(jī)制不同的藥物聯(lián)用時α=0，作用機(jī)制相同的藥物聯(lián)用時α=1。若CI＜1，認(rèn)為兩藥協(xié)同，CI=1為相加，CI＞1為拮抗。由于芹菜素和順鉑是兩種作用機(jī)制不同的藥物，故α=0。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞以4×105個/孔接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分空白對照組、AP(中效濃度)單用組、DDP(中效濃度)單用組和AP與DDP聯(lián)合用藥組(為各單用組藥物劑量的1/2)。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，離心后用70%冷乙醇固定，4℃過夜，檢測前用PBS洗去固定液，再加入0.6 ml PI染液，置4℃冰箱中染色30 min。尼龍網(wǎng)過濾后用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，每組均重復(fù)3次。

1.3.3 熒光雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期細(xì)胞以4×105個/孔加至放有蓋玻片的6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分組同“1.3.2”項(xiàng)，對照組及各藥物組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取出蓋玻片，用冷PBS洗2次，將混勻的PI/Hoechst33258熒光染料混合液滴加于長有細(xì)胞的蓋玻片表面并使它均勻覆蓋，避光、室溫反應(yīng)5 min，將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及顏色改變以區(qū)分出活的、凋亡及壞死細(xì)胞并照相。在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞呈彌漫均勻的藍(lán)色熒光，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見多個濃染致密的顆粒塊狀強(qiáng)藍(lán)色熒光，如細(xì)胞核為均勻的紅色熒光時為壞死細(xì)胞。

1.3.4 RT-PCR 檢測 bax、bcl-2 mRNA 的表達(dá) 按以上實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞48 h后，參照文獻(xiàn)［10］略改動，按TRIzol試劑盒說明一步法提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成第一鏈cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。bax上游引物5'-GGG TCT GTT TGC TTT AGG-3'，下游引物5'-GGC TGC TCC AAG GTCA-3'，擴(kuò)增片斷329 bp;bcl-2上游引物5'-TGG CGT CCC AGG TAG AT-3'，下游引物5'-CGC AGA GGC TGT CAC TT-3'，擴(kuò)增片斷 235 bp;GAPDH上游引物5'-GGT GAA GGT CGG TGT CAA CG-3'，下游引物 5'-GAG CCC TTC CAC GAT GCC AA-3'。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓100 V，電泳約50 min，紫外透射儀觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 兩藥單用及合用時不同濃度的增殖抑制效應(yīng)AP、DDP單用及合用時隨著藥物濃度增加其增殖抑制效應(yīng)也增加，并呈劑量依賴性(Fig 1)，兩藥合用時對CNE-2Z細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于各單用給藥組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)。按中效方程式計算出兩藥單用時AP的IC50為 48.21 μmol·L－1，DDP 的 IC50為 16.34 μmol·L－1，合用時 IC50為21.58 μmol·L－1(其中兩藥各自需要的濃度 AP 為14.39 μmol·L－1，DDP 為7.19 μmol·L－1)。

Fig 1 Inhibitory effects of AP，DDP and AP combined DDP with different concentrations on CNE-2Z cells

2.2 AP、DDP合用時相互作用分析 利用中效原理判定兩藥合用的效果。Fig 2結(jié)果顯示，當(dāng)fa＞20%時(即所需兩藥物濃度逐漸增大時)兩藥合用指數(shù)CI＜1，為協(xié)同效應(yīng)。在20% ＜fa＜50%范圍時，隨著兩藥物濃度的增大其協(xié)同作用加大，當(dāng)fa＞50%時，隨著兩藥物濃度的增大其協(xié)同作用逐漸減弱。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 AP、DDP單用及合用作用CNE-2Z細(xì)胞48 h后，單用藥組及合用藥組均可誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡，其中合用組誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨(dú)用藥和對照組，組間比較差別有顯著性(P＜0.05)，見Fig 3。

2.4 熒光雙染法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 AP、DDP單用及合用作用 CNE-2Z細(xì)胞 48 h，經(jīng) Hoechst33258/PI雙重染色后，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組染成強(qiáng)藍(lán)色，核呈固縮狀或圓珠狀的凋亡細(xì)胞和染成紅色的壞死細(xì)胞(Fig 4 D)的現(xiàn)象較AP或DDP單用組(Fig 4 B，C)明顯增多;而空白對照組以活細(xì)胞(細(xì)胞核染色質(zhì)呈均勻分布的藍(lán)色，F(xiàn)ig 4 A)為主，未見凋亡細(xì)胞。

Fig 2 The relationship of the fa with the combination index when AP combined with DDP

Fig 3 Apoptotic rate of CNE-2Z cells by different treatment after 48 h

2.5 對CNE-2Z細(xì)胞bax、bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 如Fig 5所示，AP、DDP單用及合用作用CNE-2Z細(xì)胞48 h后，均可上調(diào)bax和下調(diào)bcl-2 mRNA表達(dá)，但聯(lián)合用藥組上調(diào)bax和下調(diào)bcl-2 mRNA表達(dá)更加明顯，通過軟件對它們光密度積分值分析，組間比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

近年來，隨著診療技術(shù)的進(jìn)步，早期局部腫瘤的治愈率大大提高。但是對于侵襲、轉(zhuǎn)移性的晚期腫瘤，化療仍然是主要的治療手段。雖然化療能延長晚期腫瘤患者的生存期和提高他們的生活質(zhì)量，但化療過程中化療藥物對機(jī)體的損害，以及腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和治療的失敗。因此，尋找既具有抗腫瘤作用又能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性且無明顯毒副作用的天然藥物，是目前腫瘤防治研究的必然趨勢。

Fig 4 Apoptosis detected by Hoechst33258/PI fluorescent staining(×200)

Fig 5 Expression of bax and bcl-2 mRNA in CNE-2Z cells by different treatment after 48h

近年來，AP作為一種新型高效低毒的抗腫瘤藥物已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。但有關(guān)AP抗鼻咽癌作用的實(shí)驗(yàn)研究尚未見報道。因此，利用AP抗鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)值得深入研究。本實(shí)驗(yàn)MTT等結(jié)果提示AP具有抗鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞增殖的作用，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系，其主要的作用機(jī)制可能與直接抑制細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

聯(lián)合用藥是目前化療的主要手段，當(dāng)多種藥物聯(lián)合作用時，如何確定藥物配伍的最佳濃度及作用時間以減少藥物的毒副作用和提高藥物殺腫瘤細(xì)胞作用，國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者通常引入中效原理和聯(lián)合指數(shù)來進(jìn)行評價［10］。本實(shí)驗(yàn)利用中效原理分析AP和DDP兩種藥物之間的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們聯(lián)合應(yīng)用時各自的IC50濃度均比單用時各自的IC50濃度要小，且在中高濃度范圍時呈協(xié)同效應(yīng);此外，低濃度的AP與DDP聯(lián)合用藥，取得了單藥AP或DDP高濃度時才能得到的療效，提示AP能提高CNE-2Z細(xì)胞對DDP的敏感性。

目前研究認(rèn)為，大多數(shù)化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用，而腫瘤細(xì)胞由于遺傳因素或化療藥物等外源因素的誘導(dǎo)，引起凋亡通路中的抗凋亡蛋白過量表達(dá)，促凋亡因子低表達(dá)或失活以及存活信號通路活性增強(qiáng)，這些異常改變單獨(dú)或共同作用，使得腫瘤細(xì)胞凋亡缺陷，對多種化療藥物誘導(dǎo)的凋亡不敏感［11］。因此，通過調(diào)整紊亂的凋亡通路是提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的策略。最近研究發(fā)現(xiàn)，AP的放、化療增敏作用可能與其通過調(diào)整腫瘤細(xì)胞的凋亡通路有關(guān)，如Watanabe等［12］研究發(fā)現(xiàn)AP可提高X線照射條件下肺癌SQ25細(xì)胞內(nèi)p21/WAFl的表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)，從而增加肺癌細(xì)胞對放療的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Choi等［13］發(fā)現(xiàn)AP能下調(diào)ErbB2的表達(dá)和降低Akt活性，增加乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞對5-氟脲嘧啶的敏感性，促使細(xì)胞凋亡;胡太平等［14］發(fā)現(xiàn)低濃度的AP降低HL-60細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)凋亡的抗性，與下調(diào)NF-κB和Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

bcl-2基因家族在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用，其基因家族蛋白之間的比例影響著細(xì)胞對各種凋亡刺激分子的敏感性，決定caspases活化與否，從而決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡［15］，其中Bcl-2/Bax比值決定了接受凋亡刺激后，細(xì)胞發(fā)生凋亡的易感性。Bcl-2過剩，細(xì)胞存活，而當(dāng)Bax過剩，形成Bax同源二聚體，細(xì)胞將易發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:低濃度的AP聯(lián)合DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率、上調(diào)bax和下調(diào)bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯高于單獨(dú)用藥和對照組，提示低濃度的AP可通過促凋亡作用和降低細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)凋亡的抗性，增強(qiáng)CNE-2Z細(xì)胞對DDP的敏感性。

綜上所述，AP作為一種植物提取的活性成分，結(jié)合其不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，渴望其能成為一種理想的化療增敏劑。

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