劉 卓，隋海娟，閆恩志，劉婉珠，金 英

(遼寧醫(yī)學院1.藥理學教研室，2.機能實驗中心，遼寧 錦州 121001)

星形膠質細胞(astrocyte，AC)是哺乳動物中樞神經系統(tǒng)內分布最廣泛的膠質細胞，能合成分泌多種神經遞質、激素及神經營養(yǎng)因子，維持著神經元內外環(huán)境、免疫調節(jié)和信號轉導等功能［1］。AC在致炎因素的刺激下被激活對神經元即有保護作用，也能分泌細胞毒因子、炎癥因子和補體蛋白，其中一些炎癥介質反過來誘導更多的小膠質細胞趨活化，另一些則導致局部的組織損傷，從而損害神經元［2－3］?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明激活的AC引起的炎癥反應、氧化應激是如阿爾采末病(Alzheimer's disease，AD)的重要病理機制［4］。IL-1β是激活的AC分泌的作用最強的炎癥介質之一，不僅能導致神經元淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein，APP)明顯表達，而且也可以加速神經纖維纏結形成。因為IL-1β可以促使tau蛋白病變的形成和發(fā)展，推測IL-1β可能是AD發(fā)展和演進的早期病理因子［5－6］。

吡格列酮 (pioglitazone，Pio)是噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinedione drugs，TZDs)中的一種，可通過激活過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receotor-γ，PPARγ)對神經細胞有直接的保護作用［7］，還能抑制神經膠質細胞的激活及中樞炎癥介質的分泌［8］。本研究采用LPS損傷模型，觀察Pio對培養(yǎng)的大鼠乳鼠皮質星形膠質細胞產生IL-1β的影響，并進一步探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 Pio由日本TaKeDa公司提供(批號:060901，純度＞99%)，臨用時用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶 解。DMSO、LPS、DMEM、胰蛋白酶(trypsin，1 ∶250)和 L-多聚賴氨酸(poly-L-lysine)均購自Sigma公司;SP600125購于廈門勵遠有限公司;新生胎牛血清、HEPES、馬血清購于北京華美轉導科技有限公司;磷酸化JNK1/2(Thr183/Tyr185，#9251)、磷酸化 c-Jun(Ser63，#9261)，購于Cell Signaling公司。IL-1β的ELISA試劑盒為武漢博士德生物科技有限公司產品。

1.2 大腦皮層星形膠質細胞的培養(yǎng) 取出生1～2 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，無菌條件下取出大腦皮層，剔除血管和軟腦膜，剪碎后加入0.125%胰蛋白酶37℃消化。待細胞分散后，終止消化。200目篩網過濾、離心，用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，調整細胞密度為1×108～109L－1，接種在75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每3天換液1次，第9天將培養(yǎng)的星形膠質細胞置于水浴恒溫振蕩器上，37℃、260 r·min－1、18 h，舍棄含脫落細胞的細胞懸液，以去除少突膠質和小膠質細胞，仍貼壁的細胞大部分為星形膠質細胞。用0.25%胰蛋白酶溶液消化后離心，完全培養(yǎng)基重懸，接種于兩個75 cm2培養(yǎng)瓶中，以傳代。細胞傳2～3代后進行實驗。

1.3 實驗分組及給藥方法 取培養(yǎng)第2～3代星形膠質細胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，待細胞增殖融合成單層，按加入藥物不同分為① 對照組:加入0.1%的DMSO;② LPS組:LPS用培養(yǎng)基新鮮配置，終濃度為10 mg·L－1，作用24 h;③ Pio組:加入不同濃度的 Pio(0.1、1.0、10.0 μmol·L－1)作用1 h后再加入LPS繼續(xù)作用24 h;④ SP600125 組:加入 SP600125(10.0 μmol·L－1)作用1 h后再加入LPS共同作用24 h或單獨加SP600125作用24 h。

1.4 ELISA法測定星形膠質細胞上清液中IL-1β含量 星形膠質細胞傳2～3代后進行分組，藥物處理24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液。上清液離心，分裝，－80℃凍存。根據(jù)ELISA法測定培養(yǎng)液中IL-1β的含量。

1.5 免疫熒光染色法檢測星形膠質細胞IL-1β的表達 星形膠質細胞經藥物處理后，移去培養(yǎng)基，用冷的PBS漂洗2次。4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3次，每次10 min。0.3%TritonX-100作用30 min，PBS漂洗3次，每次10 min。3%山羊血清封閉30 min;加入IL-1β抗體(1∶100)4℃過夜，PBS漂洗后，加入TRITC標記的二抗作用2 h，PBS漂洗。熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照。

1.6 Western blot法檢測磷酸化JNK、c-Jun蛋白表達水平 細胞經實驗因素處理后，離心收集。放入預冷的裂解緩沖液中，4℃超聲粉碎后，12 000×g離心30 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。用10% ～12%的SDS-PAGE分離蛋白質，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質電轉移至PVDF膜上，取出后將膜放入3%BSA封閉液中，封閉60 min，再用TBST洗膜3次，每次10 min。將膜放入一抗中(1∶500)，4℃孵育過夜。TTBS沖洗后，將膜放入相應二抗(1∶1 000)中，室溫孵育1～2 h，漂洗3次。將膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余試劑，放置化學發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進行ECL化學發(fā)光，分析結果。

2 結果

2.1 Pio對LPS激活的星形膠質細胞IL-1β釋放的影響 應用ELISA方法測定了星形膠質細胞上清液中IL-1β含量，結果表明LPS(10 mg·L－1)刺激后星形膠質細胞培養(yǎng)液中IL-1β含量明顯增加，Pio(0.1，1.0 μmol·L－1和 10.0 μmol·L－1)可明顯抑制LPS引起的星形膠質細胞IL-1β的產生，且隨著濃度的增加，抑制作用越來越明顯。SP600125可對抗LPS引起的星形膠質細胞IL-1β產生增加(P＜0.01)，說明LPS引起的IL-1β產生增加與激活JNK信號轉導通路有關，單獨應用SP600125對正常IL-1β無明顯作用(Tab 1)。

Tab 1 Effects of pioglitazone and SP600125 on LPS-induced production of IL-1β in cultured medium of astrocytes(±s，n=6)

Tab 1 Effects of pioglitazone and SP600125 on LPS-induced production of IL-1β in cultured medium of astrocytes(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group

Group Dose/μmol·L －1 IL-1β/ng·L －1 Control － 7.43 ±1.62 LPS － 181.52 ±25.28＊＊LPS+Pio1 0.1 158.98 ±22.56#LPS+Pio2 1 125.98 ±16.85##LPS+Pio3 10 106.25 ±14.62##LPS+SP600125 10 76.40 ±14.88##SP600125 10 6.49 ±2.18

2.2 免疫熒光觀察Pio對LPS引起的星形膠質細胞IL-1β表達水平的影響 為了更進一步證明Pio對LPS引起的星形膠質細胞IL-1β表達水平的影響，本實驗采用免疫熒光的方法進行了深入的研究。正常情況下星形膠質細胞IL-1β幾乎不表達(Fig 1A)，LPS刺激后星形膠質細胞IL-1β表達水平明顯增加(Fig 1B)，Pio(1.0 μmol·L－1)能明顯抑制 LPS的作用，使IL-1β表達水平明顯降低(Fig 1C)。

2.3 Pio對星形膠質細胞磷酸化JNK1、c-Jun蛋白水平的影響 結果顯示，LPS作用于星形膠質細胞后，磷酸化 JNK1、c-Jun蛋白水平明顯增加 (P＜0.01)，Pio(0.1，1.0 μmol· L－1和 10.0 μmol·L－1)可明顯對抗LPS導致星形膠質細胞的磷酸化JNK1、c-Jun蛋白水平增加(P ＜0.05，P ＜0.01);但總量 JNK1(Total-JNK1，T-JNK1)、總量 c-Jun(Totalc-Jun，T-c-Jun)蛋白表達幾乎沒有改變(Fig 2，3)。

3 討論

AD患者的腦內發(fā)現(xiàn)有明顯的膠質細胞反應，老年斑周圍有大量的活化的AC包裹［8］。活化的AC可分泌細胞炎癥介質如 IL-1β、IL-6、TNF-α 及NO等，這些物質對神經元有毒性作用，使神經元凋亡并壞死［9－11］。其中IL-1β是細胞內和體液中發(fā)揮重要作用的炎癥因子，可以通過多個環(huán)節(jié)參與神經元的損傷，包括誘導黏附分子、增加白細胞的浸潤、促進NOS的合成增加，誘導氨基酸和自由基的產生，以及啟動多種細胞因子級聯(lián)反應［12］。在AD腦中IL-1β的大量分泌造成的炎癥損傷與老年斑和神經纖維纏結的形成、營養(yǎng)不良性軸突的產生以及神經元膽堿能受體過度表達直接相關。

JNK信號傳導通路是細胞凋亡的重要信號傳導途徑，常常被環(huán)境應激如紫外線和熱休克以及炎癥因子如IL-1β和TNF-α等激活［13－14］。JNK1是JNK信號轉導通路中重要的酶，激活后能引起大量與凋亡有關的基因表達及炎癥介質的釋放。JNK激活后可磷酸化其下游c-Jun，c-Jun是細胞內的一個重要轉錄因子，可通過誘導同源或異源二聚體形成，形成活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)復合物，而上調促凋亡相關蛋白的表達發(fā)揮作用［15］。本研究用LPS刺激星形膠質細胞大量分泌IL-1β，特異性JNK阻斷劑SP600125能明顯抑制星形膠質細胞分泌IL-1β，表明JNK信號轉導通路的激活參與了LPS誘導的星形膠質細胞分泌IL-1β增加。反過來IL-1β誘導也能激活JNK信號傳導通路，促進更多的炎癥因子釋放，形成惡性循環(huán)反應造成炎癥損傷升級，從而對神經元造成嚴重損傷［16］。

Fig 1 Effects of pioglitazone on LPS-induced expression of IL-1β in cultured cortical astrocytes in rats

Fig 2 Effects of pioglitazone on LPS-induced phospho-JNK1 level in astrocytes in rats(±s)

Pio是TZDs類藥物，廣泛用于治療2型糖尿病，研究發(fā)現(xiàn)其可通過激活PPAR-γ信號轉導途徑發(fā)揮抗炎作用，在治療炎癥性疾病方面有很大的應用前景［17－18］。本實驗表明Pio能有效降低星形膠質細胞分泌IL-1β水平，來達到對星形膠質細胞炎癥損傷的保護作用，且一定范圍內呈劑量依賴性。對Pio抗炎癥機制的進一步探索顯示，Pio能部分下調LPS引起的磷酸化JNK1、c-Jun蛋白的水平，則表明了Pio的抑制星形膠質細胞分泌IL-1β的作用與其下調JNK信號轉導通路有關，而其具體的抗炎機制還有待于進一步研究。

Fig 3 Effects of pioglitazone on LPS-induced phospho-c-Jun level in astrocytes in rats(±s)

［1］ Verkhratsky A，Olabarria M，Noristani H N，et al.Astrocytes in Alzheimer＇s disease［J］.Neurotherapeutics，2010，7(4):399 －412.

［2］ Dong Y，Benveniste E N.Immune function of astrocytes［J］.Glia，2001，36:180 －90.

［3］ Lee J W，Lee Y K，Yuk D Y，et al.Neuro-inflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment through enhance-ment of beta-amyloid generation［J］.J Neuroinflammation，2008，29(5):37.

［4］ Fuller S，Steele M，Münch G.Activated astroglia during chronic inflammation in Alzheimer＇s disease-do they neglect their neurosupportive roles［J］.Mutat Res，2010，690(1 －2):40 －9.

［5］ Bellucci A，Westwood A J，Ingram E，et al.Induction of inflammatory mediators and microglial activation in mice transgenic for mutant human P301S tau protein［J］.Am J Pathol，2004，165(5):1643－52.

［6］ Kitazawa M，Oddo S，Yamasaki T R，et al.Lipopolysaccharide-induced inflammation exacerbates tau pathology by a cyclin-dependent kinase 5-mediated pathway in a transgenic model of Alzheimer＇s disease［J］.J Neurosci，2005，28;25(39):8843 － 53.

［7］ 隋海娟，金 英，潘月星，等.吡格列酮對脂多糖引起大鼠大腦皮質神經元損傷的抑制作用［J］.中國藥理學與毒理學，2009，23(6):423－30.

［7］ Sui H J，Jin Y，Pan Y X，et al.Protective effects of pioglitazone on lipopolysaccharide-induced neurotoxicity in the cultured cortical neurons［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2009，23(6):423 －30.

［8］ Bradt B M，Kolb W P，Cooper N R.Complement-dependent proinflammatory properties of the Alzheimer＇s disease beta-peptide［J］.J Exp Med，1998，3;188(3):431 －8.

［9］ Kim E J，Kwon K J，Park J Y，et al.Effects of peroxisome proliferator-activated recep-tor agonists on LPS-induced neuronal death in mixed cortical neurons:associated with iNOS and COX22［J］.Brain Res，2002，941(1 －2):1 －10.

［10］隋海娟，金 英，潘月星，等.吡格列酮對脂多糖誘導的星形膠質細胞炎性細胞因子釋放的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(9):1226－30.

［10］ Sui H J，Jin Y，Pan Y X，et al.Effects of pioglitazone on the cultured cortical astrocytes induced by lipopolysaccharide expressions of inflammatory cytokines［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(9):1226－30.

［11］劉 卓，金 英，隋海娟，等.知母皂苷對Aβ25-35引起的巨噬細胞炎癥介質釋放的抑制作用及信號轉導機制［J］.中國藥理學通報，2011，27(5):695 －700.

［11］ Liu Z，Jin Y，Sui H J，et al.Effect and signaling mechanism of SAaB on the Aβ25-35-induced the release of inflammatory mediators in cultured macrophages［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):695－700.

［12］劉 卓，金 英，劉婉珠，等.知母皂苷對脂多糖引起的大鼠學習記憶障礙和炎癥反應的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(10):1362－6.

［12］ Liu Z，Jin Y，Liu W Z，et al.Effects of SAaB on LPS-induced learning and memory disorders and inflammatory reaction in rat hippocampus［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(10):1362 －6.

［13］ Liu Z，Jin Y，Yao S Y，et al.Saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge protect neurons from amyloid β-protein fragment 25-35-induced apoptosis［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2006，20(4):295－304.

［14］ Akhtar N，Haqqi T M.Epigallocatechin-3-gallate suppresses the global interleukin-1beta-induced inflammatory response in human chondrocytes［J］.Arthritis Res Ther，2011，17;13(3):R93.

［15］ Cui Y，Wu J，Jung S C，et al.Anti-neuroinflammatory activity of nobiletin on suppression of microglial activation［J］.Biol Pharm Bull，2010，33(11):1814 －21.

［16］ Blanco A M，Vallés S L，Pascual M，et al.Involvement of TLR4/type I IL-1 receptor signaling in the induction of inflammatory mediators and cell death induced by ethanol in cultured astrocytes［J］.J Immunol，2005，15;175(10):6893 －9.

［17］ Sato T，Hanyu H，Hirao K，et al.Efficacy of PPAR-γ agonist pioglitazone in mild Alzheimer disease［J］.Neurobiol Aging，2011，32(9):1626－33.

［18］ Heneka M T，Sastre M，Dumitrescu-Ozimek L，et al.Acute treatment with the PPARgamma agonist pioglitazone and ibuprofen reduces glial inflammation and Abeta1-42 levels in APPV717I transgenic mice［J］.Brain，2005，128(Pt 6):1442 －53.