徐金華 王育良 林 琳 柏玉潔

“天人相應(yīng)”是中醫(yī)認(rèn)識(shí)人體的理論基礎(chǔ)，認(rèn)為機(jī)體的陰陽(yáng)盛衰與日、地、月運(yùn)行息息相關(guān)。近年來(lái)生物學(xué)研究證實(shí)生物體內(nèi)存在生物鐘，調(diào)控著機(jī)體生命活動(dòng)和生理功能，與日、地、月運(yùn)行的周期相適應(yīng)?，F(xiàn)代環(huán)境醫(yī)學(xué)亦揭示自然環(huán)境變化可通過(guò)調(diào)控生物鐘影響人的生理功能等，強(qiáng)調(diào)了人的生理病理狀態(tài)與自然環(huán)境如晝夜交替、季節(jié)交替等密切相關(guān)，其中最為關(guān)鍵的自然環(huán)境變化是晝夜的長(zhǎng)短，即光照節(jié)律的變化〔1〕。本文主要研究光照節(jié)律改變對(duì)大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的影響，以及中藥的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)備：健康無(wú)眼病SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供），鼠齡3周，雌性，75～85 g，均為清潔級(jí)動(dòng)物。普通家庭用36 W日光燈（菲利普照明公司）1個(gè)，定時(shí)調(diào)控開(kāi)關(guān)（上海石泰電器有限公司）1個(gè)。自制光照控制箱，規(guī)格2.0 m×0.6 m×1.2 m（長(zhǎng)×寬×高），箱頂安裝36 W日光燈管1只，箱體外裝一個(gè)定時(shí)調(diào)控開(kāi)關(guān)。羅蘭RETIPort眼科電生理檢查儀（德國(guó)），電生理不銹鋼針形電極。丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥：中藥補(bǔ)陰方由當(dāng)歸10 g、白芍10 g、熟地黃 10 g、山茱萸 10 g、菟絲子12 g、山藥15 g組成，補(bǔ)陽(yáng)方由熟地黃10 g、續(xù)斷15 g、淫羊藿10 g、丹參10 g、巴戟天10 g組成。

1.2 分組與給藥

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：健康SD大鼠45只，隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組、模型組、中藥組，每組15只。對(duì)照組飼養(yǎng)在正常晝夜交替節(jié)律的環(huán)境中，接受自然光線照射，模型組飼養(yǎng)在光照控制箱內(nèi)，接受人工光源照射。中藥組飼養(yǎng)在光照控制箱內(nèi)，接受人工光源照射，大鼠性成熟后予以中藥灌胃。大鼠在箱內(nèi)可自由飲水和進(jìn)食，箱內(nèi)溫度與室溫同，定時(shí)調(diào)控開(kāi)關(guān)自動(dòng)控制箱內(nèi)照明時(shí)間，我們?cè)O(shè)定每日光照“明”（早06∶00至晚24∶00）、“暗”（晚 24∶00 至早 06∶00） 循環(huán)交替時(shí)間為18 h/6 h，觀察時(shí)間為4個(gè)月。

1.2.2 中藥組給藥方法：SD大鼠性成熟后，陰道分泌物涂片確定動(dòng)情周期，動(dòng)情周期前半期補(bǔ)陰方灌胃，動(dòng)情周期后半期補(bǔ)陽(yáng)方灌胃，給藥時(shí)間至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，SD大鼠用藥劑量按成人臨床用量經(jīng)折算后的劑量〔2〕進(jìn)行灌胃。

1.3 檢查方法

1.3.1 視覺(jué)電生理檢查：實(shí)驗(yàn)至4個(gè)月時(shí)，各組大鼠進(jìn)行眼電生理檢查。（1）閃光視網(wǎng)膜電圖（flash electroretinogram，F(xiàn)-ERG）測(cè)試：采用不銹鋼針形電極，記錄電極安置在角膜緣，電極盡量與角膜產(chǎn)生最大接觸，參考電極插入耳緣部皮下，地電極插入尾部。記錄國(guó)際臨床視覺(jué)電生理學(xué)會(huì)（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV）建議的標(biāo)準(zhǔn) 5 項(xiàng)：暗視視桿反應(yīng)（rod response，Rod-R）、最大混合反應(yīng)（maximal combined response，Max-R）、振蕩電位（oscillatory potentials，OPs）、明視視錐反應(yīng)（coneresponse，Cone-R）、30Hz閃爍光（30HzFlicker）。

1.3.2 病理組織學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)4個(gè)月時(shí)，每組隨機(jī)取受試大鼠10只，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（50 mg/kg），顳側(cè)3點(diǎn)（或9點(diǎn)）位角鞏膜緣縫線標(biāo)記，頸脫臼法處死大鼠，隨機(jī)摘除一側(cè)眼球，保留部分視神經(jīng)，常規(guī)固定，石臘包埋，通過(guò)視神經(jīng)及標(biāo)記線經(jīng)線方向連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察SD大鼠視網(wǎng)膜病理變化。

1.3.3 視網(wǎng)膜過(guò)氧化物及抗氧化酶活性測(cè)定：實(shí)驗(yàn)4個(gè)月時(shí)，每組選取受試大鼠5只，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸脫臼法處死大鼠，迅速摘除雙側(cè)眼球，手術(shù)顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，加入生理鹽水300μl，在冰浴中手動(dòng)勻漿5 min，2500 r/min離心 10 min，取勻漿上清，再用生理鹽水1∶4稀釋待測(cè)。硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，羥胺法測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 視覺(jué)電生理檢查

對(duì)照組大鼠引出的F-ERG波形較為典型、分化好，模型組引出的F-ERG波形不典型，主要表現(xiàn)為振幅降低，其中Max-R a、b波振幅顯著下降，下降幅度分別為 54.3%、65.4%；Cone-R a、b波振幅下降，幅度分別為35.8%、38.5%；Ops OP2波振幅（OS2值）、30Hz閃爍光N1-P1振幅下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中藥組大鼠所引出的FERG波形與模型組相似，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中藥組 Max-R b波較模型組增高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

表1 各組大鼠F-ERG振幅比較（，μV）

表1 各組大鼠F-ERG振幅比較（，μV）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＞0.05，③P＜0.05（獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)）

Rod-R Max-R a波 a波對(duì)照組 17.25±4.12 94.47±5.21模型組 10.29±2.98① 43.81±4.65①中藥組 13.24±4.13①② 51.17±2.86①②組別b波b波b波45.86±3.9642.67±4.35①39.87±6.31①②256.39±6.3293.25±3.32①124.25±2.82①③Cone-R a波9.34±5.236.24±5.15①6.71±3.15①②52.73±3.8732.25±3.59①39.29±2.91①②Ops OS2 30Hz Flicker N1-P1 90.42±3.87 23.38±4.3467.47±5.03① 8.48±3.54①66.46±5.27①② 10.08±3.14①②

2.2 病理組織學(xué)觀察

HE染色光學(xué)顯微鏡觀察：對(duì)照組視網(wǎng)膜各層間分界清晰，內(nèi)、外核層細(xì)胞核密集，胞核排列整齊規(guī)則，內(nèi)、外叢狀層疏松呈網(wǎng)狀，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核大，淡染（圖1A）。模型組視網(wǎng)膜普遍萎縮變薄，層次不清，層數(shù)減少，排列紊亂（圖1B）。中藥組與模型組相似（圖1C）。

圖1 各組SD大鼠視網(wǎng)膜光學(xué)顯微鏡像（HE ×40）。 1A.對(duì)照組：視網(wǎng)膜各層分界清晰，內(nèi)、外核層排列整齊。1B.模型組：視網(wǎng)膜萎縮變薄，層數(shù)減少，排列紊亂。1C.中藥組：視網(wǎng)膜萎縮變薄，層數(shù)減少，排列紊亂

2.3 視網(wǎng)膜過(guò)氧化物以及抗氧化酶活性分析

對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜MDA含量低，SOD活性高，與模型組及中藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中藥組 SOD活性比模型組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MDA含量比模型組低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表 2）。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜MDA、SOD濃度比較（）

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜MDA、SOD濃度比較（）

注：MDA濃度：對(duì)照組與模型組比較t=23.63，P=0.000；對(duì)照組與中藥組比較t=15.41，P=0.01；中藥組與模型組比較t=2.34，P=0.102。SOD濃度：對(duì)照組與模型組比較t=38.97，P=0.000；對(duì)照組與中藥組比較t=12.01，P=0.001；中藥組與模型組比較t=4.39；P=0.022。MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

組別 MDA濃度/（nmol/mg蛋白） SOD濃度/（U/mg蛋白）對(duì)照組 0.785±6.37 114.325±4.25模型組 2.556±7.15 60.554±5.88中藥組 2.037±6.73 73.317±7.19

3 討論

光照環(huán)境的改變對(duì)生物節(jié)律的影響是目前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)〔2〕，生物節(jié)律是生物體重要的生命活動(dòng)，調(diào)控著機(jī)體生理病理變化，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明干擾了動(dòng)物的生物鐘可造成多種損害，而人為調(diào)整恢復(fù)生物節(jié)律可有效地減輕或抵消生物鐘改變帶來(lái)的主體節(jié)律紊亂的不利影響。國(guó)外調(diào)整生物節(jié)律的對(duì)策主要是休息，進(jìn)行強(qiáng)制光照，或?qū)⑷朔殖沙块g型和夜間型來(lái)安排不同時(shí)間的工作。中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)天人相應(yīng)論，中醫(yī)藥在調(diào)整生物節(jié)律方面有西醫(yī)無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì)。

我院通過(guò)長(zhǎng)期的臨床和實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)出調(diào)整節(jié)律的有效方法，即中醫(yī)的陰陽(yáng)序貫法，該方法已獲取專利，此法源于著名老中醫(yī)夏桂成教授半個(gè)世紀(jì)的臨床經(jīng)驗(yàn)，又經(jīng)談?dòng)陆淌谡n題組的深入研究，已形成我院特色療法之一。夏桂成教授立足于“天人相應(yīng)”觀點(diǎn)，認(rèn)為人體生物鐘節(jié)律是依據(jù)日、月節(jié)律運(yùn)動(dòng)而變化的，并且以日節(jié)律為基本單位，人體內(nèi)陰陽(yáng)隨十二個(gè)時(shí)辰的變更消長(zhǎng)轉(zhuǎn)化，繼而擴(kuò)至月節(jié)律，日節(jié)律的紊亂可影響月節(jié)律，引起生殖周期節(jié)律紊亂〔3〕。借鑒這一觀點(diǎn)，王育良教授在實(shí)驗(yàn)中藥組采用陰陽(yáng)序貫法，意在通過(guò)調(diào)整大鼠生殖內(nèi)分泌節(jié)律，來(lái)調(diào)整大鼠的生命主節(jié)律，從而減輕或抵消生物鐘改變帶來(lái)的不利影響，使機(jī)體生理功能穩(wěn)定。

ERG是評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜功能的客觀檢查方法，廣泛應(yīng)用于各種視網(wǎng)膜損害疾病的臨床和科學(xué)研究。ISCEV建議的標(biāo)準(zhǔn)5項(xiàng)檢查從不同層面反映視網(wǎng)膜功能，對(duì)視網(wǎng)膜疾病的定位診斷具有重要的臨床意義，此方案也適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。Takahashi T等〔4〕報(bào)道54只SD大鼠持續(xù)光照24 h和48 h，2周后行ERG檢查，結(jié)果顯示Rod-R a、b波振幅，Cone-R b波振幅降低，提示光照可能主要通過(guò)損害視錐細(xì)胞使視網(wǎng)膜功能下降。本研究中，模型組及中藥組與對(duì)照組比較 Max-R a、b波振幅顯著下降，Cone-R a、b波振幅下降，Ops OS2值、30Hz閃爍光N1-P1振幅下降。已知Max-R a波起源于視網(wǎng)膜光感受器和色素上皮細(xì)胞，b波起源于視網(wǎng)膜內(nèi)層；Cone-R起源于視網(wǎng)膜錐體系統(tǒng)；OPs起源于視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞突觸電位；30Hz閃爍光起源于視網(wǎng)膜錐體系統(tǒng)，表明視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞及視網(wǎng)膜內(nèi)層功能受損傷。本實(shí)驗(yàn)視覺(jué)電生理結(jié)果及病理組織學(xué)結(jié)果與Takahashi T等報(bào)道較為一致，可見(jiàn)光是引起視網(wǎng)膜光損傷的主要原因之一。其損傷機(jī)制主要有熱損傷、機(jī)械損傷和光化學(xué)損傷等，其中光化學(xué)損傷是最常見(jiàn)的類型，這種損傷的實(shí)質(zhì)是由組織的生物化學(xué)和分子生物學(xué)變化引起的。我們?cè)诮Y(jié)果中還發(fā)現(xiàn)中藥組Max-R b波比模型組顯著增高，b波起源于視網(wǎng)膜內(nèi)層，與視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞和Müller細(xì)胞的電活動(dòng)有關(guān)，考慮中藥可能對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)層有一定的保護(hù)作用，但尚需通過(guò)大樣本資料深入研究加以證實(shí)。

抗氧化物酶SOD可清除體內(nèi)自由基，因而SOD活性的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。視網(wǎng)膜丙二醛（MDA）的量常可反映其脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，同時(shí)也反應(yīng)了細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD是視網(wǎng)膜抗氧化系統(tǒng)的主要成份，它可催化超氧化物發(fā)生歧化反應(yīng)生成性質(zhì)穩(wěn)定的無(wú)毒物質(zhì)，對(duì)于視網(wǎng)膜抵御活性氧分子的氧化攻擊，避免結(jié)構(gòu)損傷，具有重要的意義〔5〕。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)中藥組與模型組比較SOD活性高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這或許提示中藥通過(guò)提高SOD活性，增強(qiáng)了視網(wǎng)膜抵御活性氧分子的氧化攻擊的能力，從而保護(hù)視網(wǎng)膜內(nèi)層，穩(wěn)定視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞和Müller細(xì)胞的電活動(dòng)。但中藥組視網(wǎng)膜光鏡觀察與模型組相似，故我們推論光照節(jié)律改變可能對(duì)視網(wǎng)膜的發(fā)育有一定的影響，在大鼠性成熟前我們未予以藥物治療，光照節(jié)律改變對(duì)視網(wǎng)膜已造成不可逆的損傷，性成熟后予以藥物治療也只能在一定程度上起到保護(hù)作用，所以我們認(rèn)為若根據(jù)夏桂成教授調(diào)整日節(jié)律理論，在光損傷的早期用藥，可能效果更好。中藥是否如上述所示對(duì)視網(wǎng)膜有保護(hù)作用，其作用位點(diǎn)、作用機(jī)制如何，尚需通過(guò)大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究加以證實(shí)。

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