馬禮敦/復旦大學 分析測試中心、同步輻射研究中心

0 引言

X射線顯微鏡是X射線成像術(shù)的一種，也是顯微成像技術(shù)，即將微觀的、肉眼無法分辨看出的結(jié)構(gòu)、圖形放大成像以便觀察研究的器械。在《上海計量測試》2010(5，6)期的《X射線成像術(shù)》[1，2]一文中已介紹X射線成像的襯度原理、設備的構(gòu)造與主要組成部件(如X射線源、探測器等)，但主要是從宏觀物體的成像(如人體器管的醫(yī)學成像、機械制品的缺陷探傷、機場車站的安全檢查等)出發(fā)的。宏觀成像與微觀成像有相通之處，如襯度原理、設備的主要組成部件等，但也有區(qū)別。由于X射線顯微鏡是用來觀察肉眼無法分辨的微觀結(jié)構(gòu)與圖形，因而在儀器結(jié)構(gòu)和要求上有顯著不同，如要求光源尺寸小而強度大，要將像放大和高分辨等。本文主要敘述不同之處。

1 X射線顯微鏡的成像與構(gòu)造

X射線顯微鏡的成像原理與光學顯微鏡基本上是一樣的，遵從幾何光學原理，其關(guān)鍵部件是成像和放大作用的光學元件，在光學顯微鏡中為透鏡。由于X射線的波長很短，在玻璃和一般物質(zhì)界面上的折射率均接近1，故其成像放大元件不能用玻璃透鏡，現(xiàn)在一般用波帶片。此外，它們同樣利用吸收襯度和位相襯度成像，同樣要求有強光源及像探測器。對光學顯微鏡，一般用肉眼觀察，故常加一目鏡起進一步放大的作用。在X射線顯微鏡中當然不能用眼晴直接觀察，可用CCD等面探測器探測。顯微鏡的重要性能指標兩者是相似的，有放大倍數(shù)、分辨力、像差等幾個。X射線顯微鏡的一般構(gòu)造見圖1。從強光源來的光束先經(jīng)聚焦元件(在此為毛細管透鏡聚焦)使光斑尺寸變小、亮度加大，然后射到樣品上，透過樣品的光，再經(jīng)成像放大元件(在此為波帶片)而到達探測器(在此為閃爍體加CCD)。成像波帶片和探測器之間有一個Au位相補償環(huán)，在相襯成像時用。如吸收襯度成像，可移走。關(guān)于襯度，參考文獻[1]中已有提及，下文將對聚焦放大元件、光源和探測器幾個問題進行討論。

1.1 聚焦放大元件[3]

常用的聚焦鏡是多層膜反射聚焦鏡和波帶片，成像放大元件是波帶片。

圖1 X射線顯微鏡的構(gòu)造

1.1.1 多層膜反射聚焦鏡

多層膜是在基板上重復涂上兩種不同的材料制成的人造一維晶體。通常，一種材料是高原子序數(shù)的重金屬（H），另一種是低原子序數(shù)的非金屬（L）。這兩個層的厚度之和dH＋dL構(gòu)成這多層膜的重復周期d。dH和dL的大小與其比值及多層膜的性質(zhì)有關(guān)。需按實驗的要求來設計、制造，因此品種很多。最簡單的是膜厚d均勻的鏡子，但也有膜厚d是逐漸變化的鏡子。鏡面可以是曲面，可以是一維彎曲的（如圓筒面、拋物面或橢圓面等），也可以二維彎曲的（如球面或橢球面等）。圖2是多層膜橢圓面反射聚焦鏡的構(gòu)造示意圖。發(fā)散光源放在橢圓的一個焦點上，反射光聚焦在另一個焦點上。

圖2 多層膜橢圓面聚焦鏡的原理

這種一維彎曲的聚焦鏡只能在一個平面內(nèi)起聚焦作用，得到的是線焦點，與此平面垂直的方向，射線仍保持原發(fā)散情況。若要兩個方向都聚焦獲得焦點可用兩種方法：一是在兩個方向上做二維彎曲；另一是將兩塊聚焦鏡轉(zhuǎn)過90°先后放置，構(gòu)成所謂的Kikpatrick-Baez (K-B)系統(tǒng)（圖3）。K-B系統(tǒng)有較多的實際應用。

圖3 K-B系統(tǒng)示意圖

1.1.2 Fresnel 波帶片

Fresnel波帶片的原理早在100多年前就已提出，但將其用于X射線卻是近十幾年的事。波帶片的常見形狀見圖4。是由兩套不同材料制成的同心圓環(huán)交替排列構(gòu)成的，其中一種材料透光，另一種不透光。設入射光是波長為λ的平面單色光，焦距為f，設計焦點使到各相鄰環(huán)帶的距離均相差λ/2，則通過兩個相鄰透明環(huán)帶到達焦點的這兩組光程差為λ，具有相同的位相，干涉相會長。焦距為f的波帶片可以有不止一個的焦點，這些焦點f1、f2、…到各相鄰環(huán)帶的距離差分別為 3λ/2、5λ/2、…，其焦距分別為f/ 3、f/ 5、…，為不同級次的聚焦。

圖4 波帶片構(gòu)造示意圖

波帶片中各環(huán)帶的半徑R近似為式中k為中心往外數(shù)的環(huán)帶順序號，f為波帶片焦距[f= 4N(Δr)2/λ，N為環(huán)帶的總數(shù)]。波帶片各環(huán)帶的寬度是向外逐漸變小的，最外一個帶的帶寬為Δr。Δr決定了波帶片成像的衍射限分辨力δ（δ= 1.22Δr）。

上述的波帶片稱振幅波帶片，其效率較低。為了提高效率，要將不透光的部分也變成透光，同時設法使它與透過相鄰環(huán)帶的光線間的光程差不是λ/2，而是λ，相位從π變到2 π，成為同相位，干涉相就長了。方法可以是涂膜或使用兩種有不同折射率n的材料來制作波帶片，使光在通過波帶片后附加了一個相位差π。這種波帶片稱相位波帶片。理想的相位波帶片，對一級聚焦，η可達40%，比振幅波帶片提高了幾倍。圖5為金制作的波帶片的效率隨金厚度及X射線光子能量變化的曲線[3]。

圖5 金制波帶片的效率隨金厚度及X射線光子能量變化的曲線

1.1.3 毛細管

毛細管的聚焦作用是基于X射線在毛細管內(nèi)壁上的全反射，來改變X射線的前進方向?qū)崿F(xiàn)的。毛細管若是彎曲的，則會引導X射線改變方向。毛細管不是等徑而是錐狀的，則X射線就會在靠近出口處聚焦[圖6(a)]。它既可以聚焦單色X射線，也可以聚焦白色X射線?？删劢沟腦射線能量范圍約從200 eV至80 keV。

利用單根毛細管聚焦X射線束的實物在20世紀80年代已被實際應用。美國康奈爾大學用硼硅玻璃做的一根毛細管，長為1.6 m，粗頭直徑為470 μm，細頭直徑為110 μm。此管的反射效率對8 keV的射線是49%，對13 keV的射線為54%，對20 keV的射線為34%。反射效率低于100%是因為毛細管的表面并不平整，一定的起伏和粗糙度會損失部分射線。從單根毛細管射出的光束的直徑在出口處為最小，以后會慢慢增加。若毛細管出口直徑為r，則工作距離為20 μm至100 μm，此值是比較小的。

Heald等研究過毛細管的長度、進出口直徑等參數(shù)與毛細管的透過率、強度增益倍數(shù)等性能的關(guān)系，部分結(jié)果見表1。

表1 毛細管結(jié)構(gòu)參數(shù)與性能參數(shù)

毛細管除了單根利用外，還可以集束應用。毛細管束，就是將數(shù)千根毛細管平行聚集在一起的元件，整體呈圓錐狀，圖6(b)為其示意圖。一個由336根直徑為17 μm的玻璃毛細管組成的毛細管簇，可使光斑面積縮小至約1/20，功率密度可提高5倍。

從圖6可以看到，若入射光從毛細管錐體的大頭入射，則從小頭射出的光被聚焦；如入射光從較小的一頭進去，則從較大的一頭射出的光為平行光。與單毛細管相比，毛細管束的長度可以短，其焦點的面積會比單毛細管大一些，但焦點的位置離管口的距離也會大一些（有幾公分），使用起來比較方便。毛細管束還可以是中間大兩頭小的雙圓錐形，見圖6(c)。

聚焦元件還有用單晶體做的和所謂的折射透鏡，不過，它們在X射線顯微鏡中用得不多。

1.2 光源

[1]中已介紹了三類X射線光源：實驗室X射線光源(X射線管)、直線加速器和同步輻射裝置。同步輻射是既近平行又高強度，且波長可調(diào)而成為最理想的光源。未見有將直線加速器用于X射線顯微鏡，實驗室光源有使用的，但不能用焦點在10 mm×1 mm左右的封閉X射線管，可以用高功率的旋轉(zhuǎn)陽極X射線管[3，4]。另外，可用焦點尺寸在數(shù)十微米的細聚焦X射線管[4]，該管焦點小，但光亮度大，可達 2×1011～1.2×1012photos/s?sr，已接近同步輻射的光亮度，而且功耗很小，一般只有數(shù)十瓦，整機體積也小，適合作為實驗室X射線顯微鏡的光源。此外，還有用等離子X射線源[4，5]的。從光源發(fā)射出的X射線一般需先經(jīng)聚焦使光斑進一步縮小，光亮度進一步增加才照到樣品上。總的來說，實驗室光源的光亮度比較低，儀器的分辨力也低，故實驗室X射線顯微鏡應用面不廣，而同步輻射顯微鏡卻發(fā)展得很快，做出了許多很有價值的工作。

圖6 (a) 單根毛細管 (b) 毛細管束 (c) 雙圓錐形毛細管束

1.3 探測器

參考文獻[1]中已介紹的各種探測器都可用，如感光膠片、影像板(Image plate, IP)、影像增強器、半導體探測器(CCD，電荷偶合器)等。當然，宏觀用的和微觀用的在結(jié)構(gòu)和參數(shù)上是不同的。

X射線顯微鏡可按使用的X射線能量的高低分為軟X射線顯微鏡和硬X射線顯微鏡。其構(gòu)造基本相同，但研究對象有側(cè)重。前者較多應用于生物醫(yī)學體系，后者較多應用于材料醫(yī)學體系。如按其技術(shù)或原理來分類，則有透射式或掃描式顯微鏡、光譜顯微鏡、全息顯微鏡等多種。

2 透射式X射線顯微鏡[6]

圖7為透射式X射線顯微鏡的構(gòu)造示意圖。用波帶片作為聚光鏡、顯微波帶片作為成像放大物鏡、CCD為探測器,分辨力可達10 nm。將樣品連上了制冷裝置(氦氣)、轉(zhuǎn)動機構(gòu)，并使CCD與計算機連接，則可做斷層掃描(CT)，并從屏幕上直接觀察CT圖。

水窗：水窗是指從波長2.3 nm至4.4 nm的一個波段范圍。用此范圍的X射線入射于生物樣品，水中含有的氧對它們的吸收很小(＜40%)，而有機體中的碳對它們的吸收卻很高(＞60%)（見圖8），可以認為水對此波段的光是透明的，使水和氧間的襯度很高。故用此波段的光來觀察含水生物樣品，可避開氧吸收的干擾，清楚看到主要由碳構(gòu)成的有機分子的構(gòu)造。圖9為用波長為2.4 nm的X射線拍攝的冰凍Kupffer 細胞圖像，除細胞核N外、可清晰分辨出細胞核膜Me和囊泡V等[7]。

透射式X射線顯微鏡既可利用吸收襯度成像也可用相位襯度成像。這兩類儀器在構(gòu)造上略有差別，圖10為相襯顯微鏡構(gòu)造示意圖[8]。相襯顯微鏡的聚光器不是單一的波帶片，而是由環(huán)狀孔徑、波帶片和針孔構(gòu)成。環(huán)狀孔徑將入射光限制為一個環(huán)，波帶片將其單色化并聚焦在位于針孔中的試樣上，從試樣出射的光經(jīng)顯微波帶片和位于其背焦面附近的環(huán)狀相位板(添加位相)而成像在探測器上。

圖7 透射式X射線顯微鏡光路示意圖

圖8 氧和碳的吸收限和水窗

圖9 Kupffer 細胞的X射線顯微照片

圖10 相襯X射線顯微鏡光路

圖11是脂質(zhì)囊胞膜的X射線顯微照片[8]，(a)為相位襯度像，(b)為吸收襯度像，顯然，前者比后者能更清楚地看到結(jié)構(gòu)細節(jié)。

圖11 脂質(zhì)囊胞膜的X射線顯微照片

3 掃描式X射線顯微鏡[6]

在上述透射X射線顯微鏡中，整個被研究物需完全暴露在入射光束中，探測器顯示的是放大、完整的物像。在掃描式X射線顯微鏡中入射光束一般被聚焦得很細小，如幾十個納米，故物體上只有一個很小的區(qū)域被光照射，探測器上只得到這一個點的放大圖像，相對移動物體與光的位置，可逐點得到物體上各點的像，這些點像被逐點輸入計算機，經(jīng)處理后在顯示器上顯示出完整的圖像。圖12為掃描式X射線顯微鏡構(gòu)造示意圖[9]。一般用掃描臺實現(xiàn)，掃描步距可以為幾個納米?？梢允枪饴凡粍?，樣品移動逐點掃描，也可以樣品不動波帶片掃描（見圖12）。一般是樣品移動的分辨力較低，波帶片掃描的分辨力較高。聚光波帶片之后常有一個級次選擇光闌(OSA)，用來從波帶片產(chǎn)生的不同級次的衍射光中選擇需要的級次，并阻擋其他級次的光，以降低背景。

圖12 掃描式X射線顯微鏡構(gòu)造示意圖

掃描式X射線顯微鏡可以利用吸收襯度成像，也可用相位襯度成像；可得到明場像，也可得到暗場像。

4 光譜顯微鏡[10]

所謂光譜顯微鏡是將某種光譜和顯微鏡相結(jié)合的技術(shù)。此類技術(shù)頗多，只要這種光譜能產(chǎn)生一種與觀察位置有關(guān)的信號，如透射光子的計數(shù)率、總的或特定的峰的光電子產(chǎn)率、熒光產(chǎn)率等，這些信號可以給出元素的、化學的、磁的等各種信息。圖13為此類儀器光路示意圖，入射X射線經(jīng)兩次多層膜反射聚焦到試樣上，樣品可在兩個方向掃描，以得到整個圖像。探測器依據(jù)需探測的信號的性質(zhì)選擇品種、安裝位置等。如欲探測的是發(fā)生的多色熒光，則可用固體探測器在反射位置探測；如探測的是單色的透射或衍射線，則可用閃爍計數(shù)器或CCD等測定；如被探測的是光電子，則需用電子分析器探測。

4.1 NEXAFS顯微鏡

圖13 光譜顯微鏡構(gòu)造示意圖

這是將X射線吸收光譜[11]與X射線顯微鏡結(jié)合的技術(shù)。NEXAFS是X射線吸收光譜中靠近吸收邊的那一段光譜。對一些有機或生物分子，如核酸與蛋白質(zhì)、聚苯乙烯PS和有機玻璃PMMA或PEP等，由于它們均由C、H、O等輕元素構(gòu)成，利用一般的吸收襯度是不能區(qū)別的。但如選擇某種特定波長的X射線，則可將它們區(qū)分出來。這是因為在不同化合物中的C、H、O有著不同的近鄰配位結(jié)構(gòu)，因而它們的外層能級結(jié)構(gòu)不同，造成它們的X射線近邊吸收光譜不同，故可比較它們的NEXAFS譜，找出它們的吸收有巨大差異的能量，用這種能量的X射線入射，則一種物質(zhì)吸收小而另一種吸收大，可以造成大的吸收襯度，明顯地將它們加以區(qū)別。圖14右下圖為三元高聚物中三個組分PS、PMMA和PEP的NEXAFS譜?？煽闯觯谌肷渚€能量為285.15處，PS吸收很大，另兩個幾乎不吸收；在能量為287.6處，PEP吸收大，另兩者吸收小；而在能量288.4處是PMMA吸收很大，而PS和PEP吸收很小。分別用這三個能量的單色X射線做掃描X射線顯微鏡觀察，所得顯微圖像分別位于圖14的左上、右上和左下。這三個圖的暗處分別表示了PS、PEP和PMMA的存在。從這些顯微圖像上可分辨出三個組份各自的形態(tài)和相互之間關(guān)系。此三元聚合物中的大顆粒主要由PS構(gòu)成，PS中存在許多小顆粒，是為PMMA，而大顆粒之間充填的是PEP[12]。

圖14 三元聚合物的光譜顯微圖像和譜圖

4.2 磁X射線顯微鏡

同步輻射中所含的輻射均是偏振光，可以是線偏振光，也可以是橢圓或圓偏振光，X射線也不例外。如果待測物質(zhì)具有磁性，則具有不成對電子，具有電子自旋磁矩和軌道磁矩。磁矩與不同方向的偏振光的作用是不同的，如用不同方向的圓(線)偏振光照射磁性材料，可以得到不同的吸收譜，該性質(zhì)稱圓(線)二色性。把用左右圓(線)偏振光得到的不同的吸收譜相減就得到圓(線)二色譜。圖15是德國BESSYⅡ的磁X射線顯微鏡的示意圖[13]。X射線源來自一同步輻射裝置中的橢圓波蕩器，經(jīng)前置鏡使其準直，濾波后經(jīng)一離軸波帶片聚焦，再經(jīng)單色器(由三塊平晶組成)使其成為單色光，并聚焦到試樣上，經(jīng)試樣吸收后的光用一顯微波帶片成像并放大，像用CCD探測。在試樣臺上裝有可以施加不同方向外磁場的系統(tǒng)。

4.3 光電子發(fā)射顯微鏡[10]

光電子發(fā)射顯微鏡是利用X射線在樣品上激發(fā)出光電子來放大成像的裝置。如要研究磁性材料，則和磁顯微鏡一樣，入射光需偏振X光。圖16右為光電子發(fā)射顯微鏡構(gòu)造示意圖[14]，與電子顯微鏡類似，由幾個電磁透鏡起成像放大作用。圖16左下為樣品磁疇構(gòu)成示意圖，由四個不同磁矩方向(用箭頭表示)的磁疇構(gòu)成，入射圓偏振X射線與不同磁疇的作用不同，激發(fā)出光電子不同，故所成之像不同，可區(qū)別出4個磁疇（圖16左上）。

圖15 磁X射線透射顯微鏡

圖16 X射線光電子發(fā)射顯微鏡

圖17[14]上圖為生長于Cu(100)面上的Co (4ML)/Cu (6ML)/Ni(15ML)三層膜(Cu層沒畫出，Co層在上)示意圖。用波長與Co L3吸收邊的波長相同的X射線照射，Co層強烈吸收，Ni層吸收少，獲得Co層的磁疇像，示于圖17下右。顏色不同的區(qū)域表示磁化方向不同，上圖Co層內(nèi)的兩個箭頭表示磁化方向，是在平面內(nèi)的；換用與Ni L3吸收邊能量相同的X射線入射，則得到的是Ni層的磁疇像，見圖17下左。磁疇呈條狀平行排列，但磁化方向不在平面內(nèi)，而是與平面垂直，示于上圖。Ni、Co層的磁疇形狀不同，但Co層的結(jié)構(gòu)似與Ni層的條狀結(jié)構(gòu)有一些關(guān)系。

圖17 Co(4ML)/Cu(6ML)/Ni(15ML)三層膜層分辨磁疇像

圖18(a)是利用線偏振光的光路示意圖。線偏振光以與樣品表面小于15°角的方向入射，若是s偏振，則電矢量與樣品表面平行；若是p偏振，則電矢量與樣品表面法線成15°角。圖18(b)為利用能量位于Ni L吸收邊的線偏振光拍攝得到的Ni(100)表面上的反鐵磁疇的光電子發(fā)射像，呈現(xiàn)出Ni表面條狀的反鐵磁疇結(jié)構(gòu)[15]。

5 X射線全息顯微術(shù)[6]

已經(jīng)知道，像是依靠吸收襯度(光的振幅)或位相襯度一種信息來顯現(xiàn)的。而所謂全息，是指同時含有振幅與位相兩種信息。這是Gabor在1948年提出的。由于目前的記錄介質(zhì)實際可記錄的信息只能是光強，也即振幅，故需將位相信息轉(zhuǎn)換成強度來記錄。把光照射到試樣上，試樣以球面波形式將其散射，如有另一束已知振幅與位相的、未經(jīng)散射的直射參考光，兩者的波前相遇時因經(jīng)過的途程長度l與l0不同，存在位相差，故會干涉，則合成的總強度是既與原光的振幅有關(guān)，又與兩光的位相差有關(guān)。故此總強度包含了振幅與位相兩種信息[圖19(a)]。這樣的干涉圖是全息圖，并不是原物體的像，怎樣才可從干涉圖獲得原物體的圖像呢？需通過圖像再現(xiàn)。這就要用激光來照射記錄下的干涉圖，其發(fā)出的波前仍和參考源相同，但其干涉圖又與試樣的波前一致，從而再現(xiàn)原物體。全息顯微過程是由全息記錄和波前再現(xiàn)兩步構(gòu)成的。

圖18 線偏振光的(a)光路、(b)磁疇像

圖19 X射線全息顯微原理圖

X射線熒光全息(XFH)[16]已被用來獲取局域原子的結(jié)構(gòu)。在熒光全息中，入射X射線激發(fā)試樣中感興趣元素的熒光。熒光的一部分直接射向探測器，另一部分被其周圍的原子散射，散射熒光射向探測器，與直射熒光發(fā)生干涉而得到這一方向k的全息強度I(k)[圖19(b)]。在一個相當大的立體角范圍內(nèi)改變探測器的位置，也即改變方向，改變l、l0的長度，改變了位相差，則每一方向得到的干涉強度是不同的，其全體即為全息譜。

熒光全息還有另一種實現(xiàn)方法，為多能X射線全息(MEXH)，其光路是XFH的倒轉(zhuǎn)，探測器和激發(fā)光源互換位置[圖19(c)]。入射光一部分被近鄰原子散射，散射波到熒光發(fā)生原子處與直接到達的入射光發(fā)生干涉，熒光發(fā)生原子接受到的光強是上兩光的干涉結(jié)果，故該原子發(fā)射的熒光強度是與干涉結(jié)果相關(guān)聯(lián)的。與XFH類似，改變?nèi)肷涔獾奈恢?，以得到不同方向的I(k)，加合得到全息圖。改變?nèi)肷涔獾牟ㄩL，可得不同波長的全息圖，加大了倒易空間中的采樣范圍，避免像的畸變。加和這些全息圖還可有效解決孿生像的問題。Marchesini等用XFH法研究了準晶Al70.4Pd21Mn8.6的結(jié)構(gòu)[17]。實驗是在歐洲同步輻射裝置ID22波蕩器光束線上進行，入射光能量為16 keV。圖20(a)為實驗全息圖，經(jīng)積分變換得到的實空間的原子結(jié)構(gòu)見圖20(b)。聯(lián)接其中最亮的12個點可看出準晶的五角二十面體特征。

圖20 Al70.4Pd21Mn8.6的(a)XFH全息圖、(b)原子結(jié)構(gòu)圖

6 X射線顯微鏡與其他顯微鏡的比較

表2中列出了X射線顯微鏡與其他顯微鏡幾項主要性能的比較?？煽闯龈鞣N顯微鏡均有自已的特色及適用范圍。分辨力最高的是電子顯微鏡，其次是X射線顯微鏡。由于電子的穿透力非常低，故電子顯微鏡適用在表面形貌和結(jié)構(gòu)的分析，而X射線有強的穿透力，故可做塊體分析，甚至做斷層掃描(CT)。X射線顯微鏡的另一特點是可與各種光譜結(jié)合成光譜顯微鏡，大大擴大了它的應用范圍。

表2 X射線顯微鏡與其他顯微鏡比較

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