楊 軍，趙坤耀，胡 寧，謝 琳，楊 靜

（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030;2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所眼科，重慶 400042;3.重慶通信學(xué)院軍事信息工程系，重慶 400035）

0 引言

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一種用于細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究的重要方法［1］。研究細(xì)胞的功能、代謝以及細(xì)胞對(duì)環(huán)境諸因素影響的反應(yīng)等需要一個(gè)既能使細(xì)胞脫離復(fù)雜環(huán)境的直接影響，又能維持正常生命活動(dòng)的條件。這一條件的建立離不開培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)箱。細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境可由培養(yǎng)基提供［2］，而細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境參數(shù)則可由細(xì)胞培養(yǎng)箱提供。

常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)箱能精確地提供細(xì)胞培養(yǎng)需要的溫度、濕度、氣體環(huán)境，性能穩(wěn)定、響應(yīng)迅速、可靠性高，且能有效防范對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的污染。但是常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)箱尺寸、質(zhì)量都較大，很難在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞樣本的遠(yuǎn)距離傳輸中派上用場(chǎng)。這就需要一種參數(shù)控制相對(duì)精確、體積小、質(zhì)量輕的便攜式細(xì)胞培養(yǎng)箱。這種裝置還可以用于某些不經(jīng)常進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室開展臨時(shí)或者短期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的需要。

目前市面上的便攜式細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品在溫度控制上主要有水套式加熱和氣套式加熱2種。這2種溫度控制方式實(shí)現(xiàn)較為簡(jiǎn)單，但存在一個(gè)共同的缺點(diǎn)，即不能進(jìn)行降溫。當(dāng)培養(yǎng)樣本放置區(qū)域的溫度值高于初始設(shè)定值時(shí)，溫度值的下降只能依賴于自然冷卻，因此，溫度控制不夠精確。而且，部分產(chǎn)品僅實(shí)現(xiàn)對(duì)溫度的控制，而忽略了濕度參數(shù)的影響。

本文設(shè)計(jì)了一種實(shí)用性強(qiáng)的便攜式細(xì)胞培養(yǎng)箱。采用半導(dǎo)體制冷片作為加熱和降溫的主要器件，利用超聲換能器實(shí)現(xiàn)加濕，將培養(yǎng)箱體內(nèi)溫度和相對(duì)濕度值控制在設(shè)定的范圍內(nèi)，并得了滿意的細(xì)胞培養(yǎng)效果。

1 儀器設(shè)計(jì)與制作

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的整體設(shè)計(jì)

根據(jù)便攜式培養(yǎng)箱需要實(shí)現(xiàn)的功能，整個(gè)系統(tǒng)包括箱體和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，箱體主要用于內(nèi)外環(huán)境的隔離。系統(tǒng)原型中（圖1），箱體由有機(jī)玻璃粘合而成，尺寸為300 mm×250 mm×200 mm。內(nèi)部結(jié)構(gòu)主要由主控模塊、主要功能模塊和人際交互模塊3個(gè)部分組成，其中，主要功能模塊實(shí)現(xiàn)溫度和相對(duì)濕度的測(cè)量與控制。

圖1 便攜式細(xì)胞培養(yǎng)箱Fig 1 Portable cell incubator

1.2 傳感器檢測(cè)部分

系統(tǒng)中，溫度和濕度的檢測(cè)選用 Sensirion公司的SHT11溫濕度傳感器。SHT11傳感器同時(shí)產(chǎn)生溫度、相對(duì)濕度信號(hào)，經(jīng)過內(nèi)部電路放大，送到A/D轉(zhuǎn)換器進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換、校準(zhǔn)和糾錯(cuò)，再通過二線串行接口將溫度值和相對(duì)濕度值送至單片機(jī)PIC16F877A，最后利用單片機(jī)完成非線性補(bǔ)償和溫度補(bǔ)償。

1.3 溫度控制部分

溫度控制選用半導(dǎo)體制冷片TEC—12706。它基于熱電偶對(duì)，即把一只N型半導(dǎo)體和一只P型半導(dǎo)體連接成電偶，兩端加上直流電后，在接口處就會(huì)產(chǎn)生溫差和熱量的轉(zhuǎn)移。在電路上串連起若干對(duì)半導(dǎo)體熱電偶對(duì)就構(gòu)成了一個(gè)常見的制冷熱電堆。借助熱交換器等各種傳熱手段，使熱電堆的熱端不斷散熱并保持一定的溫度，而把電熱堆的冷端放到工作環(huán)境中去吸熱降溫，這就是半導(dǎo)體制冷的原理［3，4］。

溫度控制部分將計(jì)算后得到的測(cè)量溫度值與初始設(shè)定的溫度值對(duì)比，再通過單片機(jī)兩路輸出端口電平值的變化，切換半導(dǎo)體制冷片的工作狀態(tài)。

1.4 濕度控制部分

濕度控制部分選用超聲霧化加濕器。超聲霧化加濕是利用電子高頻振蕩（振蕩頻率為1.7～2.4 MHz），通過陶瓷霧化片的高頻諧振，將液態(tài)水分子結(jié)構(gòu)打散而產(chǎn)生水霧，不需加熱或添加任何化學(xué)試劑［5］。

系統(tǒng)中設(shè)置的初始濕度值為80%RH，將通過線性補(bǔ)償和溫度補(bǔ)償計(jì)算后得到的相對(duì)濕度值與80%RH相比，再通過單片機(jī)的一個(gè)端口輸出對(duì)應(yīng)高低電平，控制超聲霧化加濕器工作狀態(tài)的導(dǎo)通或截止，為系統(tǒng)加濕。

1.5 人機(jī)交互部分

人機(jī)交互部分的功能是初始溫度值的設(shè)定與參數(shù)值的顯示。針對(duì)不同溫度值的需求，設(shè)置一個(gè)初始輸入設(shè)置，使系統(tǒng)箱體以設(shè)置的溫度值作為控制的目標(biāo)值。顯示的參數(shù)值包括設(shè)置的初始值和經(jīng)過補(bǔ)償計(jì)算得到的溫濕度值。

2 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

軟件設(shè)計(jì)的主要任務(wù)是進(jìn)行傳感器測(cè)量值的修正和利用PID控制算法確定單片機(jī)脈寬調(diào)制（pulse width modulation，PWM）輸出的占空比。

2.1 傳感器測(cè)量值的修正

由SHT11傳感器的DATA數(shù)據(jù)總線直接輸出測(cè)得的相對(duì)濕度值數(shù)字量，需要進(jìn)行線性補(bǔ)償和溫度補(bǔ)償，溫度值數(shù)字量需要進(jìn)行修正［6］。

按照下面的等式可以計(jì)算得到相對(duì)濕度測(cè)量值SORH的線性補(bǔ)償值RHlinear

其中，C1，C2，C3為線性補(bǔ)償系數(shù)。測(cè)量值SORH線性補(bǔ)償后的溫度補(bǔ)償值RHtrue為

其中，T為測(cè)試濕度值時(shí)的溫度，t1和t2為溫度補(bǔ)償系數(shù)。由于SHT11是采用PTAY能隙材料制成的溫度敏感元件，具有很好的線性輸出。實(shí)際溫度值可由下式算得

其中，d1和d2為特定系數(shù)，d1的取值與SHT11的工作電壓有關(guān)，d2的取值則與SHT11內(nèi)部A/D轉(zhuǎn)換器采用的分辨率有關(guān)。

2.2 PID控制PWM占空比

本文采用增量式PID算法控制單片機(jī)PWM輸出脈沖的占空比，調(diào)節(jié)半導(dǎo)體制冷片的工作狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)對(duì)溫度部分的控制。PID子程序流程圖如圖2所示。

圖2 PID子程序流程圖Fig 2 Flow chart of the PID sub program

溫度的控制可以分為三段:自由變溫段、PID控制段、自然變溫段。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)區(qū)域由初始溫度開始到80%設(shè)置溫度值為自由變溫段;±20%設(shè)置溫度范圍內(nèi)為PID控制段;當(dāng)溫度偏差在±1℃時(shí)，為自然變溫段。當(dāng)溫度偏差值在允許的范圍內(nèi)，而此時(shí)系統(tǒng)處于自然變溫段，半導(dǎo)體制冷片不工作。

3 實(shí)驗(yàn)分析

在本設(shè)計(jì)中，細(xì)胞培養(yǎng)空間的大小為138 mm×200 mm×133 mm，半導(dǎo)體制冷片采用水冷方式散熱。半導(dǎo)體制冷片產(chǎn)生的熱量與超聲霧化加濕器產(chǎn)生的濕氣，通過風(fēng)扇經(jīng)過單孔板導(dǎo)入箱體中細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域［7］。

3.1 溫度控制實(shí)驗(yàn)研究

室溫28℃，當(dāng)設(shè)定溫度值為25℃時(shí)，箱體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域溫度隨時(shí)間的變化曲線如圖3所示。

圖3 溫度隨時(shí)間的變化曲線Fig 3 Curve of temperature change with time

培養(yǎng)區(qū)域的初始溫度值為28.0℃ ，經(jīng)過1 min，半導(dǎo)體制冷片已經(jīng)實(shí)現(xiàn)將培養(yǎng)區(qū)的溫度降至24.8℃。在隨后的過程里，培養(yǎng)區(qū)的溫度一直在25.0℃附近來(lái)回波動(dòng)，偏差在±1℃以內(nèi)，符合系統(tǒng)設(shè)計(jì)溫度控制的技術(shù)指標(biāo)要求。

3.2 濕度控制實(shí)驗(yàn)研究

測(cè)量60 min內(nèi)系統(tǒng)箱體培養(yǎng)區(qū)域的相對(duì)濕度值隨時(shí)間的變化如圖4。

培養(yǎng)區(qū)域的初始相對(duì)濕度值為71%RH，5 min以內(nèi)超聲霧化加濕器加濕至96%RH，并且在一段時(shí)間內(nèi)維持在98%RH。從第40 min左右開始，培養(yǎng)區(qū)內(nèi)的相對(duì)濕度值開始出現(xiàn)微小下降，但仍然保持在90%RH以上，符合系統(tǒng)設(shè)計(jì)要求。

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究

圖4 相對(duì)濕度測(cè)量結(jié)果Fig 4 Measurement result of the relative humidity

實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞樣本為人腎上皮細(xì)胞HEK293。將一份HEK293細(xì)胞樣本傳代為3份，分別培養(yǎng)在標(biāo)號(hào)為A，B，C的培養(yǎng)瓶。把培養(yǎng)瓶A，B，C分別放入常規(guī)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、自制便攜式培養(yǎng)箱和常溫實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)前后的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況如圖5所示。

圖5 不同環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果對(duì)比Fig 5 Comparison of cells cultivation result in different environment

經(jīng)過3 d不同環(huán)境的培養(yǎng)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好，自制便攜式細(xì)胞培養(yǎng)箱中細(xì)胞的生長(zhǎng)的情況比CO2培養(yǎng)箱中稍差，常溫環(huán)境中的細(xì)胞瓶中只有一些死細(xì)胞，而且存在污染。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:本設(shè)計(jì)的系統(tǒng)箱體在短期內(nèi)能維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，只是由于缺乏CO2氣體環(huán)境來(lái)維持pH值，細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)要稍差一些。

4 結(jié)論

本文新設(shè)計(jì)制作的便攜式細(xì)胞培養(yǎng)箱采用單片機(jī)PIC16F877A作為主控器件，將溫濕度傳感器、半導(dǎo)體致冷片、超聲換能器等器件結(jié)合在一起，控制并顯示箱體內(nèi)的溫濕度值。使用半導(dǎo)體致冷片作為加熱和降溫的主要器件，解決了部分便攜式培養(yǎng)類產(chǎn)品無(wú)法實(shí)現(xiàn)降溫的缺陷。采用霧化加濕，克服了部分產(chǎn)品無(wú)加濕功能的不足。與現(xiàn)有大多數(shù)便攜類的產(chǎn)品相比，新的系統(tǒng)成本更低，更利于攜帶與遠(yuǎn)距離傳送實(shí)驗(yàn)樣本。

但是，設(shè)計(jì)中溫度控制采用的是一般常規(guī)的控制—反饋方法，其實(shí)質(zhì)是一個(gè)滯后的控制［8］，控制精度有限，今后，可考慮引入模糊控制器，以期獲得更高的控制精度和更快的響應(yīng)。

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