西安市第一醫(yī)院（西安710002） 譚 楠

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的氣道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，T淋巴細(xì)胞在哮喘發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的具有特異細(xì)胞膜表面分子和核轉(zhuǎn)錄因子的一類T細(xì)胞亞群，叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）是Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子［1］。國內(nèi)外研究證實(shí)哮喘患者體內(nèi)，CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)量較正常人減少［2－4］，但有關(guān)Foxp3在哮喘中作用研究較少。本研究通過檢測(cè)不同分期及不同疾病嚴(yán)重程度哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA表達(dá)水平，初步探討Foxp3在哮喘發(fā)病中的作用。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 選擇2010年1～6月在我院住院的哮喘患者63例，男30例，女33例，平均年齡34．65±8．36歲。所有患者均符合2003年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制訂的支氣管哮喘防治指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分為急性發(fā)作期36例（其中輕中度23例，重度13例），非急性發(fā)作期27例。正常對(duì)照組40例，男19例，女21例，平均年齡32．79±8．15歲，為我院健康體檢者，均無過敏病史及家族史，近期無感染及其它疾病。

2 方 法 采集研究對(duì)象肘靜脈肝素抗凝血5 ml，利用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入1 ml Trizol試劑裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Fer mentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成的c DNA。根據(jù)文獻(xiàn)［5］合成Foxp3及內(nèi)參照GAPDH引物，具體引物序列如下：Foxp3 上 游 引 物 5＇－CTACGCCACGCTCATCCGCTGG－3＇，下游引物5＇－GTAGGGTTGGAACACCTGCTGGG－3＇，內(nèi)參照 GAPDH 上游引物5＇－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3＇，下 游 引 物 5＇－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3＇。20μl PCR 反應(yīng)體系如下：10μl SYBRRPre mix Ex TaqTMⅡ（2×）、2μmol/L上、下游引物各2μl、6．0μl c DNA。采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其程序如下：95℃預(yù)變性30s，95℃5s、60℃30s 40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后利用Bio－Rad IQ520 Standar d Edition Optical Syste m Soft ware V2．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 哮喘組和對(duì)照組Foxp3 mRNA表達(dá)水平的比較 見表1。哮喘組患者外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表1 哮喘組和對(duì)照組Foxp3 mRNA表達(dá)水平的比較

2 不同臨床分期哮喘組Foxp3 mRNA表達(dá)水平的比較 見表2。急性發(fā)作期患者外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯降低，與非急性發(fā)作期患者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表2 不同臨床分期哮喘組Foxp3 mRNA表達(dá)水平的比較

3 急性發(fā)作期不同嚴(yán)重程度哮喘患者Foxp3 mRNA表達(dá)水平的比較 見表3。急性發(fā)作期重度哮喘患者外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯降低，與輕中度患者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表3 急性發(fā)作期不同嚴(yán)重程度哮喘患者Foxp3 mRNA表達(dá)水平的比較

討 論

哮喘的發(fā)病機(jī)制不完全清楚，可能與免疫反應(yīng)、神經(jīng)反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性有關(guān)，研究證實(shí)免疫功能紊亂參與了哮喘的發(fā)病過程，輔助性T細(xì)胞（主要是Th2細(xì)胞）數(shù)量增加或功能異常與哮喘發(fā)病密切相關(guān)。1995年Sakaguchi等人首先報(bào)道了小鼠體內(nèi)天然存在CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞，隨后在人外周血中也發(fā)現(xiàn)了該群細(xì)胞。越來越多實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞在自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫耐受及抗感染免疫等方面發(fā)揮重要的作用［6－8］。

我們前期研究結(jié)果［2］顯示在哮喘患者體內(nèi)CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)量較正常人減少，在哮喘的疾病活動(dòng)中起著重要作用，是導(dǎo)致哮喘患者細(xì)胞免疫失調(diào)的重要原因，這與國內(nèi)外研究結(jié)果一致［2－4］。Foxp3在CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用，是該群細(xì)胞的一個(gè)特征性標(biāo)志［1］，為了研究Foxp3在哮喘發(fā)病中的作用，我們利用熒光定量PCR檢測(cè)不同分期及不同疾病嚴(yán)重程度哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA明顯低于正常對(duì)照組，這與CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)量減少一致。Foxp3在CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞的發(fā)育及功能成熟過程中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)oxp3在哮喘患者體內(nèi)表達(dá)降低，可能使CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)量減少，抑制其功能的發(fā)揮，從而打破了CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間的平衡，使Th2細(xì)胞增殖和活化增強(qiáng)，導(dǎo)致哮喘的發(fā)生。目前Foxp3對(duì)Treg細(xì)胞功能基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚，F(xiàn)oxp3可能抑制Treg細(xì)胞活化過程中的多個(gè)關(guān)鍵基因及激活其他許多基因的表達(dá)來參與Treg細(xì)胞的發(fā)育及功能成熟過程。同時(shí)我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在急性發(fā)作期及重度患者體內(nèi)Foxp3 mRNA表達(dá)水平均明顯降低，提示Foxp3與哮喘的分期及病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，F(xiàn)oxp3不僅與哮喘的發(fā)生有關(guān)，而且在其病程進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯降低且與疾病分期及病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平降低可能在哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮作用，但具體的機(jī)制需要進(jìn)一步研究證實(shí)。隨著對(duì)CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞及Foxp3的研究不斷深入，有可能通過上調(diào)Foxp3的水平使CD4＋CD25＋Treg數(shù)量增加或功能增強(qiáng)，重建CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間的平衡，為哮喘治療提供新的思路。

［1］Marson A，Kretsch mer K，F(xiàn)ra mpton GM，et al．Foxp3 occupancy and regulation of key tar get genes during T－cell sti mulation［J］．Nature，2007，445（7130）：931－935．

［2］譚 楠，吳昌歸．哮喘患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)及臨床意義［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2007，36（1）：102－104．

［3］Durrant DM，Metzger DW．Emerging roles of T helper subsets in the pathogenesis of ast h ma［J］．Immunol Invest，2010，39（4－5）：526－549．

［4］Robinson DS．Regulator y T cells and asth ma［J］．Clin Exp Allergy，2009，39（9）：1314－1323．

［5］Zhao Z，Wu Y，Cheng M，et al．Activation of Th17/Th1 and Th1，but not Th17，is associated with the acute cardiac event in patients with acute coronary syndro me［J］．At herosclerosis，2011，217（2）：518－524．

［6］Palo mares O，Yaman G，Azkur AK，et al．Role of Treg in i mmune regulation of aller gic diseases［J］．Eur J Immunol，2010，40（5）：1232－1240．

［7］Ki m JM，Rudensky A．The role of the transcription factor Foxp3 in the develop ment of regulator y T cells［J］．Immunol Rev，2006，212：86－98．

［8］Allan SE，Broady R，Gregori S，et al．CD4＋T－regulator y cells：toward therapy for hu man diseases ［J］．Immunol Rev，2008，223：391－421．