趙秀巖，王曉靜，付 博，葉肇云，柳銀黎

（原子高科股份有限公司，北京 102413）

亞甲基二膦酸（MDP）是雙磷酸類藥物，在臨床上主要用于檢查骨骼的血供和代謝方面的病變；經(jīng)99TcO4－標記后的產(chǎn)品（云克）用作類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎等疾病的治療劑。由于MDP生產(chǎn)過程中會引入一些雜質(zhì)，這些雜質(zhì)（特別是亞磷酸）的存在可能會影響藥物臨床用藥的安全有效性，而且其用量也是嚴格控制的，因此MDP原料藥中亞磷酸含量分析是質(zhì)量控制中的一項重要指標。

MDP屬雙磷酸類藥物，是一種焦磷酸類似物，是將后者的P－O－P連接用P－C－P連接代替。由于其結(jié)構(gòu)中無生色團，極性也較強，因此該類藥物的質(zhì)量控制一般采用重量分析法［1］、酸堿滴定法［2］、絡(luò)合滴定法［3］和分光光度法［4］、柱前或柱后衍生反相高效液相色譜法［5－8］等方法。這幾種分析方法的缺點是特異性較差，其中柱前或柱后衍生法較繁瑣，而且僅能檢測到雙磷類藥物，而不能對其分解產(chǎn)物進行檢測；其他幾種方法的特異性較差。本研究擬采用反相短碳鏈C8色譜柱以減少雙膦酸在柱上的吸附，配以通用型蒸發(fā)光散射器代替?zhèn)鹘y(tǒng)的紫外檢測器對各相關(guān)物質(zhì)進行檢測，以解決MDP及相關(guān)物質(zhì)的分離及檢測問題。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和裝置

液相色譜系統(tǒng)：高效液相色譜儀（美國waters公司）、Alltech2000ES蒸發(fā)光散射檢測器（美國奧泰公司）和CSChrom Plus色譜工作站（美國科學(xué)系統(tǒng)SSI公司）。

1.2 主要試劑

甲醇（色譜純）、磷酸二氫鈉和亞磷酸：均為國產(chǎn)分析純；MDP 對照品：Toronto Reserch Chemicals Inc提供；正戊胺：純度99%，美國Alfa Aesar產(chǎn)品。

1.3 色譜條件

色譜柱：Symmetry C8色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）：Waters公司；流 動相：V （30 mmol／L正戊胺（用乙酸調(diào)節(jié)pH 5.0））∶V（甲醇）＝98∶2；流速：1mL／min。

蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）：漂移管溫度110℃，氣體流量：2.7L／min；撞擊器位置：off，增益：1。在上述條件下，MDP的理論塔板數(shù)為2 141，分離度為10.4，拖尾因子0.97。

2 實驗方法

分別將磷酸二氫鈉、亞磷酸、MDP對照品進樣至高效液相色譜系統(tǒng)，采用反相高效液相色譜法分析其MDP含量，確定樣品的保留時間。在相同條件下對MDP原料進行反相高效液相色譜分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗條件的確定

3.1.1 檢測器的選擇 MDP分子中有二個膦酸基體，極性強，易電離，分子結(jié)構(gòu)中無生色團，因此不能用常規(guī)的紫外檢測器或熒光檢測器間接檢測。由于ELSD是通用的質(zhì)量型檢測器，對檢測室中的各種物質(zhì)均有響應(yīng)，它的檢測不依賴于樣品分子中的官能團，因此對于無生色團的磷酸、亞磷酸、MDP等有關(guān)物質(zhì)可同時檢測，避免了衍生對分析的干擾，因此，本工作選用ELSD作為檢測器。

3.1.2 ELSD實驗條件 ELSD的參數(shù)選擇主要是霧化氣體的流速和漂移管的溫度。以信噪比為考察指標，考察了漂移管溫度對檢測器靈敏度的影響。結(jié)果顯示，溫度過低，流動相揮發(fā)不完全、噪音大、雜峰多、信噪比??；溫度過高，部分樣品揮發(fā)，且檢測的靈敏度降低。在溫度為110℃時，信噪比最大。因此選擇漂移管溫度為110℃。

霧化器氣體流量對檢測靈敏度的影響：實驗發(fā)現(xiàn)，氣體流速過小，流動相揮發(fā)不完全、背景噪音大；而流速過高，霧化形成的物質(zhì)微粒小、散射能力弱、靈敏度降低。當空氣流速為2.7L／min時，樣品的信噪比最大，因此選擇霧化器氣體流量為2.7L／min。

3.1.3 離子對試劑的選擇 離子對反相液相色譜常用四丁基季銨鹽做離子對，但由于四丁基季銨鹽不具有揮發(fā)性，因此不能直接應(yīng)用于ELSD。本實驗采用可揮發(fā)的正戊胺做為離子對試劑，結(jié)合ELSD檢測器，克服了四丁基季銨鹽離子對流動性與ELSD不相匹配的缺點。

3.2 影響色譜行為的因素

在反相高效液相色譜中，影響物質(zhì)在色譜柱上保留的主要因素包括流動相的pH、流動相的濃度、流動相中有機溶劑及無機溶劑的比例，通過實驗考察了以上各因素對有關(guān)物質(zhì)色譜峰的影響，并確定實驗的最佳條件。

3.2.1 pH對分離的影響 配制濃度30mol／L的正戊胺溶液，用乙酸調(diào)其pH為4～7，甲醇體積含量為2%，考察不同pH對磷酸、亞磷酸及MDP保留值的影響，結(jié)果示于圖1。圖1顯示，隨著pH增加，各組分保留值增加。譜峰變寬，當pH為5.0時，譜峰最佳，且滿足分離要求，因此選擇流動相的pH為5.0。

3.2.2 流動相濃度的影響 分別配制濃度為25～40mmol／L正戊胺溶液（用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.0），甲醇體積含量為2%，考察不同流動相濃度對磷酸、亞磷酸及MDP保留值的影響，結(jié)果示于圖2。圖2顯示，隨著流動相濃度的增加，各組分的保留值減小，磷酸及亞磷酸分離變差。為保證充分的分離，選用濃度30mol／L的正戊胺溶液。

3.2.3 甲醇含量的影響 甲醇體積含量為0～5%時對各組分的影響結(jié)果示于圖3。由圖3可以看出，隨著甲醇體積含量的增加，各組分的保留值減小，為保證各組分的充分分離，選用甲醇體積含量為2%。

3.3 最佳條件下的色譜分析

選用30mmol／L的正戊胺，pH 5.0，甲醇體積含量為2%時，MDP、磷酸及亞磷酸的色譜分離結(jié)果示于圖4。由圖4可以看出，MDP與其相關(guān)物質(zhì)在合適的保留時間內(nèi)達到良好的分離。

圖1 pH對保留值的影響▲——MDP；■——亞磷酸；◆——磷酸

圖2 流動相濃度對保留值的影響▲——MDP；■——亞磷酸；◆——磷酸

圖3 甲醇體積含量對保留值的影響▲——MDP；■——亞磷酸；◆——磷酸

圖4 MDP與相關(guān)物質(zhì)的分離色譜圖1——磷酸；2——亞磷酸；3——MDP

3.4 線性范圍

MDP在600～4 000mg／L范圍內(nèi)峰面積A的對數(shù)值lgA濃度C對數(shù)值lgC呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：lgA＝1.943 6lgC＋16.212，r＝0.999 6，檢出限為200mg／L。

3.5 精密度與重復(fù)性

在優(yōu)化色譜條件下，取濃度為2.07g／L的MDP對照品溶液，連續(xù)進樣6次，MDP峰面積的相對偏差為1.07%。

3.6 回收率

取濃度為920mg／L和299mg／L MDP對照品溶液，按兩點法進樣進行色譜分析，并對分析結(jié)果進行線性回歸，另外配制3個已知濃度的MDP對照品溶液，做空白加樣回收，結(jié)果列于表1。由表1可以看出，回收率為98%～102%，符合檢測要求。

3.7 樣品測定

采用兩點法進樣，對三批樣品進行測量，結(jié)果列于表2。由表2可見，MDP質(zhì)量含量為95.0%～98.1%，符合檢測要求。

表1 加樣回收率（n＝3）

表2 樣品測量結(jié)果（n＝3）

4 結(jié) 論

采用反相高效液相色譜法／ELSD測定MDP及有關(guān)物質(zhì)，方法的線性范圍為600～4 000mg／L，r＝0.999 6，檢出限為200mg／L，回收率在98%～102%，適用于MDP原料的質(zhì)量控制。

［1］ 邢玉仁，劉金榮.HEDP含量測定的研究［J］.山東醫(yī)藥工業(yè)，1997，16（2）：17.

［2］ 包光林，李康齡，王守良，等.羥基乙叉基二磷酸的直接滴定分析［J］.化學(xué)試劑，1991，13（1）：59－60.

［3］ 徐繼紅，陳為民.Th－EDTA絡(luò)合滴定法測定羥乙膦酸二鈉片含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，1999，15（4）：56－57.

［4］ 張彥凱，樊淑彥，郝麗恩，等.分光光度法測定阿倫磷酸鈉片劑含量［J］.分析化學(xué)，2000，28（9）：1 181.

［5］ Sparidans RW，Hartigh JD，Vermeij P.High－performance ion－exchange chromatography with inline complexation of bisphosphonates and their quality control in pharmaceutical preparations［J］.J Pharm Boomed Annl，1995，13：1 545.

［6］ 樓永明.FMOC柱前衍生化HPLC法測定阿倫膦酸鈉片含量及有關(guān)物質(zhì)4－氨基丁酸［J］.中國藥事，2009，23：974－977.

［7］ Peng SX，Dansereau SM.Iox－exchange liquis chromatographic analysis of bisphosphonates by ionline post－coumn ph105otchemical reation and spectrophotometric detection ［J］.J Chromatogr A，2001，914：105.

［8］ Usui T，Watanabe T，Higuchi S.Determination of a new bisphosphonate，YM175，in plasma，urine and bone by high－performance liquid chromatography with electrochemical detection［J］.J Chromatogr，1992，584：213－220.