天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院 馬旭光 張宗舟 柳 蕓 趙國嬋

甘肅省航天育種工程技術(shù)研究中心 霍建泰

目前，在產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的眾多微生物中，黑曲霉因其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶提取容易、酶活力高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)而明顯優(yōu)于其他菌種。但長期以來，由于在實(shí)際生產(chǎn)中缺乏優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株，β-葡萄糖苷酶活性低、產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差等問題至今尚未解決。黑曲霉ZM-8是一株經(jīng)航天誘變選育出的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的突變株，該菌株能發(fā)酵小麥秸稈粉和玉米秸稈粉等纖維質(zhì)并產(chǎn)生具有較高活力的β-葡萄糖苷酶 （劉星斌等，2009）。通過前期試驗(yàn)，已優(yōu)化了影響玉米秸稈粉為主要原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的主要因素，包括麩皮添加量、氮源及其含量、含水量和接種量等（馬旭光等，2011）。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，對(duì)影響該菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和初始pH等主要環(huán)境因素進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)該菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，以期為利用該菌株工業(yè)化生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及在飼料中的規(guī)模化應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)酵菌種 黑曲霉ZM-8（Aspergillus nigerZM-8），經(jīng)航天誘變后由天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院微生物工程實(shí)驗(yàn)室和中國科學(xué)院天水航天育種基地聯(lián)合選育獲得（馬旭光等，2007）。目前保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC NO：M209125）。

1.1.2 主要試劑及儀器 水楊酸苷購于Sigma公司，3，5-二硝基水楊酸等其他試劑均為國產(chǎn)分析純；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)（湘儀儀器廠），722型分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）。

1.1.3 發(fā)酵原料 玉米秸稈粉：取無霉變、干燥的玉米秸稈，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過40目篩；麩皮為市售。

1.1.4 種子培養(yǎng)基 玉米秸稈粉10 g，Mandels營養(yǎng)鹽溶液[2%（NH4）2SO4，0.05%MgSO4·7HO2，0.01%KH2PO4]25mL（Mandels等，1976），pH 自然。

1.1.5 基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基 玉米秸稈粉60%，麩皮40%，Mandels營養(yǎng)液 250%（V/m），pH 自然。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵方法 將活化的黑曲霉ZM-8斜面種子，用無菌生理鹽水洗脫，制成濃度為106～107CFU/mL的孢子懸浮液，按6%（V/m）的接種量接種到種子培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)72 h后，將制備的固體曲按1∶10接種量接種到基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，35℃恒溫培養(yǎng)72 h后測(cè)定β-葡萄糖苷酶。

1.2.2 酶活力的測(cè)定 產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵后，取生長良好的固體曲5 g，加入一定量的蒸餾水，于30℃保溫1 h，用沙芯漏斗過濾，然后10000 r/min冷凍離心10 min，提取上清液定容至100 mL，得1∶20粗酶液。取適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5 mL，加入底物為1.5 mL 0.5%的水楊酸苷緩沖液，并向?qū)φ赵嚬苤屑尤?.5 mL DNS溶液以鈍化酶活性，然后在50℃保溫0.5 h，取出后立即向待測(cè)試管中加入1.5 mL DNS溶液以中止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5 min，冷卻后在540 nm的波長下測(cè)定OD值（許曉鵬等，2008）。取35%～80%飽和度（NH4）2SO4的沉淀溶解液作產(chǎn)酶條件研究；取過DEAE-52柱后的β-葡萄糖苷酶活性組分酶液作酶學(xué)性質(zhì)研究 （潘利華等，2008）。酶活力單位定義：在一定的反應(yīng)條件下（pH、溫度），每分鐘由1 mL粗酶液水解底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）；相對(duì)酶活力：以各自處理?xiàng)l件下的最高酶活力為100%，取各自活性最大值的相對(duì)活性。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007和SPSS Statistics17.0軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株培養(yǎng)36 h后可見白色菌絲，之后會(huì)產(chǎn)生大量厚絨狀氣生菌絲，60 h前后出現(xiàn)黑色孢子。由圖1可見，β-葡萄糖苷酶在發(fā)酵72 h時(shí)達(dá)到了產(chǎn)酶高峰，酶活為35.10 U/mL；之后酶活逐漸下降，這可能是還原糖的累積抑制了β-葡萄糖苷酶的分泌所致。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 微生物的生長和產(chǎn)物的合成均是在各種酶催化下進(jìn)行的，溫度是保證酶活性的重要條件。由圖2可見，在低于35℃條件下，酶活隨溫度的增加而不斷升高；之后酶活開始下降。結(jié)合發(fā)酵過程中菌株的生長情況分析其原因可能是低發(fā)酵溫度，不利于菌體生長，會(huì)延長產(chǎn)酶延滯期和發(fā)酵周期，酶活力也較低；適宜的溫度菌體生長較快，且有利于酶的分泌。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.3 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中的pH會(huì)影響菌體的生長與產(chǎn)物的合成，進(jìn)而對(duì)產(chǎn)酶造成很大的影響。由圖3可見，在初始pH4.0～5.5時(shí)，酶活隨pH的升高而逐漸提高，酶活最高值可達(dá)40.15 U/mL；之后開始降低，在中性條件下酶活力不到最高值的1/2。究其原因可能是酸度過高或低的環(huán)境會(huì)抑制菌株的正常生長，導(dǎo)致產(chǎn)酶量較低。

圖3 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.4 最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化 在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（33）正交試驗(yàn)，以優(yōu)化各培養(yǎng)條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1，極差分析和方差分析的結(jié)果分別見表2和表3。由表2和表3可知，各因素對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活影響的主次順序是依次是：A>B>C，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活影響達(dá)到極顯著水平；初始pH值達(dá)顯著水平。綜合考慮，該菌株發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最適發(fā)酵條件為A2B3C2，即發(fā)酵時(shí)間為72 h，發(fā)酵溫度為35℃，初始pH為5.5。在此條件下進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果的復(fù)證試驗(yàn)，β-葡萄糖苷酶活達(dá)58.95 U/mL，優(yōu)化效果較為理想。

表1 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素和水平表

表2 產(chǎn)酶條件正交試驗(yàn)極差分析表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.5 β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響及其熱穩(wěn)定性 由圖4可知，β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，當(dāng)高于55℃時(shí)，酶活力急劇下降。由圖5可知，該酶在55℃時(shí)，保溫2 h后仍具有95%以上的酶活力，且穩(wěn)定性較好，而在65℃和75℃時(shí)，穩(wěn)定性較差，保溫1 h后，酶活均只保留了40%左右，這與王劍鋒等（2010）由黑曲霉水解京尼平苷產(chǎn)β-葡萄糖苷酶所分離純化的BGL2組分的研究結(jié)果基本一致，而略高于王云和曾沃坦（2010）由黑曲霉S菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度。

圖4 溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響

圖5 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性

2.5.2 pH對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響及其pH穩(wěn)定性 由圖6可知，β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH為5.0，當(dāng)反應(yīng)體系中pH小于3.0或大于7.0時(shí)，酶活性基本喪失。由圖7可知，該酶在pH 3.0～6.0時(shí)較穩(wěn)定，酶活力可保持在80%以上。

圖6 pH對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響

圖7 β-葡萄糖苷酶的pH 穩(wěn)定性

3 討論

發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和初始pH值培養(yǎng)條件不僅會(huì)影響微生物菌體生長狀況，而且會(huì)影響其產(chǎn)酶量的多少。研究表明，同一種微生物的不同菌株其生產(chǎn)周期和發(fā)酵規(guī)律不盡相同 （趙林果等，2008）。因此，明確該菌株適宜的產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間有助于在實(shí)際生產(chǎn)中及時(shí)終止發(fā)酵，提高生產(chǎn)效率。有研究報(bào)道，黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最適發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)出如下規(guī)律：液態(tài)發(fā)酵周期長于固態(tài)發(fā)酵，以營養(yǎng)價(jià)值較高的麩皮等為主要原料的發(fā)酵周期長于以營養(yǎng)價(jià)值較低的玉米秸稈、小麥秸稈、甘蔗渣等為主要原料的周期（羅建平等，2007）。但從發(fā)酵原料的貯存量和應(yīng)用價(jià)值的角度來考慮，以來源廣泛、價(jià)格低廉的纖維質(zhì)資源為發(fā)酵原料生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶更有意義。黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最適發(fā)酵溫度大多數(shù)在30℃左右（許曉鵬等，2008；李平等，1999）。但本試驗(yàn)的最佳發(fā)酵溫度為35℃，原因可能是該菌株發(fā)生基因突變，在較高溫度下更有利于其產(chǎn)酶，這與潘利華等（2008）試驗(yàn)結(jié)果相似。菌株在生長繁殖期和代謝產(chǎn)物分泌期的最適pH不同，因此研究菌株產(chǎn)酶的最適初始pH非常有必要。大量研究表明，大多數(shù)黑曲霉菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH在3.5～6.0的酸性范圍，且穩(wěn)定性較好（王劍鋒等，2010；潘利華等，2008）。本試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道相近，但與王云和曾沃坦 （2009）對(duì)黑曲霉Aspergillus niger S菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的研究結(jié)果相差較大。趙林果等（2008）對(duì)黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶過程中的pH值進(jìn)行調(diào)控，結(jié)果表明，黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的最佳初始pH為5.0，而將產(chǎn)酶期的pH控制在4.0左右時(shí)，可大大提高酶活力。但本試驗(yàn)由于是固態(tài)發(fā)酵，未能實(shí)現(xiàn)pH的調(diào)控。

目前，關(guān)于酶學(xué)特性的研究，大多數(shù)都對(duì)粗酶液進(jìn)行了多級(jí)提純，然后針對(duì)不同分子質(zhì)量的各組分酶進(jìn)行各項(xiàng)酶學(xué)特性測(cè)定和動(dòng)力學(xué)研究。為此，今后應(yīng)在本試驗(yàn)基礎(chǔ)上開展對(duì)該酶的純化、酶分子的篩選、克隆和表達(dá)等方面的工作，以期為該酶在飼料中工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

4.1 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)酶活影響均達(dá)到極顯著水平 （F=14.994；F=10.872）， 初始 pH （F=5.843）對(duì)其影響達(dá)到顯著水平。

4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件：發(fā)酵時(shí)間為72 h，發(fā)酵溫度為35℃，初始pH為5.5。在此條件下，β-葡萄糖苷酶活達(dá)58.95 U/mL。

4.1 該酶最適溫度為55℃，保溫2 h后仍具有95%以上的酶活力，穩(wěn)定性良好；該酶最適pH為5.0，在pH為3.0～6.0時(shí)酶活力穩(wěn)定。

[1]劉星斌，張宗舟，藺海明，等.航天誘變黑曲霉菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44（2）：144～148.

[2]羅建平，王貴娟，潘利華.黑曲霉發(fā)酵麥麩生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的工藝優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23（12）：252～257.

[3]馬旭光，張宗舟，霍建泰.航天誘變黑曲霉ZM-8發(fā)酵玉米秸稈粉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基組分優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2011，7：114～118.

[4]馬旭光，張宗舟，藺海明，等.黑曲霉高產(chǎn)纖維素酶活突變株ZM-8的篩選[J].中國飼料，2007，5：30～32.

[5]潘利華，羅建平，羅水忠.同步輻射對(duì)黑曲霉β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生條件及酶學(xué)性質(zhì)的影響[J].食品科學(xué)，2008，29（5）：245～249.

[6]王劍鋒，陳今朝，梁華正，等.曲霉水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)[J].菌物學(xué)報(bào)，2010，29（5）：683～690.

[7]王云，曾沃坦.黑曲霉Aspergillus niger S菌株所產(chǎn)β-葡糖苷酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)[J].中國科學(xué)院研究生院學(xué)報(bào)，2009，26（2）：274～279.

[8]許曉鵬，袁士芳，劉立明.突變黑曲霉高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，27（5）：124～127.

[9]趙林果，王平，宗雅冬，等.黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶過程中pH值的調(diào)控[J].化學(xué)與生物工程，2008，25（12）：48～51.

[10]Mandels M，Andreottir R，Roche C.Measurement of saccharifing cellulose[J].Bio-technol Bioeng Symp，1976，6：21～31.