柏 云 綜述 鄭春霞 審校

外質(zhì)體(Exosomes)是直徑40～100 nm的膜性小囊泡，由細(xì)胞多泡體形成并分泌到細(xì)胞外。1981年，Trams等[1]在利用電鏡測(cè)量正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞脫落小體(直徑500～1 000 nm)時(shí)，注意到另外一群脂質(zhì)包被小體，平均直徑約40 nm。6年后，生物學(xué)家Johnstone等[2]通過(guò)超速離心法在羊網(wǎng)織紅細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離純化了一種囊泡狀物質(zhì)，直徑<100 nm，含有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等特殊蛋白成分，并保留著網(wǎng)織紅細(xì)胞的某些活性。該作者認(rèn)為這些小囊泡體是網(wǎng)織紅細(xì)胞發(fā)育為成熟紅細(xì)胞過(guò)程中清除不需要的胞質(zhì)膜蛋白成分的一種新機(jī)制，并命名為exosomes。近年來(lái)，exosomes在免疫調(diào)節(jié)等方面的作用備受關(guān)注，已成為腫瘤免疫治療的新熱點(diǎn)。

然而，尿液中exosomes的研究尚處于初期階段，獲取尿液exsomes可能成為一種新的判斷來(lái)源細(xì)胞生理學(xué)和病理學(xué)狀態(tài)的非創(chuàng)傷性方法。研究證實(shí)exosomes攜帶的mRNAs、microRNAs及其他活性分子能夠參與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，將尿液exosomes的研究延伸到臨床診斷和治療[3]。本文就exosomes的生物學(xué)起源、結(jié)構(gòu)成分、生理功能及其在腎臟疾病方面的研究進(jìn)行綜述。

Exosomes的生物學(xué)特性

Exosomes的形成Exosomes起源于細(xì)胞內(nèi)吞途徑中的多泡體。多泡體又稱晚期內(nèi)體，囊泡內(nèi)充滿數(shù)十甚至數(shù)百個(gè)腔內(nèi)小囊泡，由早期內(nèi)體腔膜中的一些特定微區(qū)向內(nèi)凹陷、脫落形成。多泡體有三種不同轉(zhuǎn)歸：(1)與溶酶體融合，導(dǎo)致內(nèi)體的相關(guān)蛋白和脂類降解；(2)不發(fā)生融合，充當(dāng)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHC-Ⅱ)分子的暫時(shí)儲(chǔ)存器，又稱為MHC Ⅱ類分子腔室(major histocompatibility complex class Ⅱ compartment，MⅡC)；(3)多泡體移向質(zhì)膜，并與之融合，腔內(nèi)的大量小囊泡釋放出來(lái)，成為exosomes(圖1)[3，4]。

內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)可能參與該途徑的調(diào)節(jié)。ESCRT由ESCRT-0，ESCRT-Ⅰ，ESCRT-Ⅱ，ESCRT-Ⅲ組成，與將泛肽化的內(nèi)吞體膜蛋白分選入多囊泡體途徑有關(guān)，參與細(xì)胞表面蛋白的降解，但目前尚不清楚多泡體途徑調(diào)控的詳細(xì)分子機(jī)制[5]。

圖1 Exosomes和微粒子的形成機(jī)制

除exosomes外，細(xì)胞還可直接由胞質(zhì)膜以出芽方式脫落而釋放另一類型小囊泡，曾被命名為微粒體、核外粒體、脫落小體和微囊泡等。此類囊泡直徑100～1 000 nm，含有與母細(xì)胞膜相似的脂類和蛋白質(zhì)成分，并可含有胞質(zhì)中的細(xì)胞器和部分mRNA(圖1)[6]。當(dāng)細(xì)胞受到一系列刺激時(shí)(如激活、凋亡)，其釋放明顯增多，產(chǎn)生過(guò)程可能與胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的濃度增加和細(xì)胞膜骨架的重構(gòu)相關(guān)[7]。與exosomes相似，微粒體也能介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于心血管疾病炎癥、妊娠及惡性腫瘤等領(lǐng)域。Exosomes與微粒體的比較見表1。

Exosomes的結(jié)構(gòu)成分樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞均能釋放exosomes，不僅體外細(xì)胞培養(yǎng)的上清可分離出exosomes，各種體液包括血液、尿液、羊水、胸水、精液均可提取exosomes。Exosomes所含有的蛋白等物質(zhì)與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)，但基本結(jié)構(gòu)大致相同。電鏡下可見exosomes呈扁平狀或球狀，為直徑30～100 nm的低密度物質(zhì)，在蔗糖溶液中的密度為1.13～1.21 g/ml，其密度與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)，并隨蛋白含量而變[9,10]。Exosomes的脂質(zhì)膜主要由雙層磷脂酸組成，脂質(zhì)成分尚不完全清楚，可能富含磷脂酰絲氨酸、膽固醇、鞘磷脂等[11]。Exosomes含有的蛋白成分可采用Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè)。目前已鑒定的exosomes含有的蛋白質(zhì)大致分為兩大類：一類是普通蛋白質(zhì)，在所有細(xì)胞來(lái)源的exosomes上均有分布，與細(xì)胞基本功能和(或)多泡體起源相關(guān)，如胞質(zhì)蛋白(微管蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)蛋白骨架等)、熱休克蛋白(Hsp70、Hsp90、Hsp84等)、跨膜蛋白(CD9、CD 37、CD63、CD81等)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(蛋白激酶、異源三聚體G蛋白等)、代謝酶類(過(guò)氧化酶、丙酮酸酯酶、脂激酶等)。另一類是特殊蛋白質(zhì)，只在一些特定的細(xì)胞上表達(dá)，與該細(xì)胞的特異功能相關(guān)，如抗原提呈細(xì)胞來(lái)源的exosomes上表達(dá)與其功能相關(guān)的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子；T淋巴細(xì)胞來(lái)源的exosomes上表達(dá)有T細(xì)胞受體、CD3、CD4、CD8，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的exosomes上表達(dá)大量的腫瘤抗原[10,12]。近年來(lái)，exosomes相關(guān)研究的一個(gè)重大突破就是遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。2007年，Valadi等[13]發(fā)現(xiàn)小鼠和人的肥大細(xì)胞系(分別是MC-9/HMC-Ⅰ)分泌的exosomes含有RNA，通過(guò)基因芯片分析證明exosomes大約有1 300個(gè)mRNA，占供體細(xì)胞mRNA的8%，且exosomes與供體細(xì)胞相比，同種類mRNA的富集程度并不相同，但具體機(jī)制尚不清楚?？俁NA分析證明microRNA的存在。該研究者最后總結(jié)exosomes含有mRNA和microRNA，并可運(yùn)輸給其他細(xì)胞，在新的細(xì)胞繼續(xù)發(fā)揮生物學(xué)功能。

表1 外質(zhì)體與微粒體生物學(xué)特性比較[8]

exosomes的生理病理功能及臨床應(yīng)用最初認(rèn)為，exosomes是細(xì)胞在成熟過(guò)程中清除不需要的或已退化蛋白成分的一種機(jī)制[2]，深入研究發(fā)現(xiàn)exosomes可以調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)。已知細(xì)胞-細(xì)胞間信息傳遞可通過(guò)多種機(jī)制完成，包括化學(xué)受體-配體結(jié)合、相鄰細(xì)胞的直接接觸及細(xì)胞-細(xì)胞突觸聯(lián)系等。Exosomes為細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和信息傳遞提供了一種新的途徑，其作用機(jī)制可通過(guò)以下三個(gè)方面(圖2)：(1)借助自身表面攜帶的黏附分子和受體，特異性地黏附在靶細(xì)胞表面(未發(fā)生膜的融合)，介導(dǎo)靶細(xì)胞受體信號(hào)的激活或下調(diào)；(2)通過(guò)與靶細(xì)胞的胞膜附著或融合將exosomes的內(nèi)容物(mRNAs、microRNAs、蛋白及信號(hào)分子)轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞；(3)通過(guò)內(nèi)陷以類似胞吞作用的機(jī)制將信息轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞[3,13]。此外，最近有研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞之間可通過(guò)免疫突觸(IS)單向傳遞含有microRNAs的exosomes[14]。

圖2 外質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞信息傳遞的三種機(jī)制

Exosomes介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞的重要作用已引起廣泛關(guān)注。1998年，Zitvogel等[15]證實(shí)樹突狀細(xì)胞經(jīng)腫瘤來(lái)源的抗原性多肽刺激分泌的exosomes(dendritic cell-derived exosomes,Dex)能夠激發(fā)體內(nèi)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞依賴的抗腫瘤效應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)[15]。自此，exosomes在腫瘤治療的作用嶄露頭角，許多基礎(chǔ)和臨床研究由此展開，成為腫瘤免疫治療的新熱點(diǎn)。Dex上含有一些特殊的蛋白質(zhì)，如MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子及共刺激分子CD86等，而這些特殊的分子表達(dá)能在體內(nèi)產(chǎn)生有效地免疫刺激，尤其是激發(fā)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，在體內(nèi)可引起有效地抗腫瘤免疫應(yīng)答[16]。因此我們有理由相信Dex可能成為一種新型生物治療載體，替代樹突狀細(xì)胞疫苗成為一種新型腫瘤疫苗。目前國(guó)外已建立了臨床型抗原遞呈細(xì)胞來(lái)源的exosomes制備和純化方法，其技術(shù)已相當(dāng)成熟和完善，實(shí)際使用的可操作性和可控性強(qiáng)。并且exosomes作為一類非細(xì)胞成分，具有體積小、易被機(jī)體清除、抗原性弱、可控性強(qiáng)及穩(wěn)定高效等優(yōu)勢(shì)。最近，一個(gè)小規(guī)模研究觀察15例黑色素瘤伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者應(yīng)用Dex后，皮膚和淋巴結(jié)的腫瘤消退，其安全性的初步評(píng)估顯示了良好的應(yīng)用前景[17]。此外，Dex在不能進(jìn)行手術(shù)(ⅢB-Ⅳ期)的非小細(xì)胞肺癌患者的維持期治療研究已完成Ⅰ期研究工作，并進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，目的在于改善化療治療后無(wú)進(jìn)展的4月生存期，同時(shí)進(jìn)行其總體有效性和安全性的評(píng)估[18]。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示exosomes可遞呈生物相關(guān)抗原、介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞，參與多種疾病(慢性炎癥、心血管疾病、腎臟疾病及腫瘤等)的發(fā)生和發(fā)展。

尿液exosomes與腎臟疾病

尿液exosomes也是來(lái)源于多泡體的膜性小囊泡，當(dāng)多泡體的外膜與胞膜融合后釋放到尿液中。幾乎所有腎臟上皮細(xì)胞包括腎小球足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞均可分泌exosomes[12,19]。

蛋白生物標(biāo)記物的來(lái)源尿液exosomes中的蛋白成分占尿液全部蛋白的3%[20]。Gonzales等[21]利用液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜系統(tǒng)(LC-MS/MS)及微軟分析技術(shù)從正常人尿液exosomes中鑒定出1 412種特異性蛋白，并清楚獲取了其中1 132種蛋白，包括先前研究報(bào)道過(guò)的205種蛋白，以及927種未曾報(bào)道的蛋白。在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man,OMIM)提供的信息表明，177種蛋白與疾病相關(guān)，其中34種蛋白與腎臟疾病相關(guān)。相當(dāng)一部分蛋白質(zhì)屬于膜內(nèi)蛋白質(zhì)，參與溶質(zhì)和水的運(yùn)輸，這些蛋白幾乎來(lái)自于所有腎小管節(jié)段的頂膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括近端小管(Na-H交換器3，鈉-葡萄糖共同轉(zhuǎn)運(yùn)體1和2、水通道蛋白1)，升支粗段[鈉鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體2(NKCC2)]、遠(yuǎn)曲小管[噻嗪類敏感的Na-Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)體(NCC)]、集合管[水通道蛋白2(AQP2)等]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究也為exosomes的生物來(lái)源提供了豐富的信息。已知exosomes是當(dāng)多泡體的外膜與所來(lái)源細(xì)胞的頂膜融合后釋放到尿液中的。有趣的是，研究中有22種蛋白經(jīng)鑒定與多泡體形成相關(guān)，這22種蛋白構(gòu)成參與相當(dāng)一部分(75%)多泡體形成的ESCRT-0，ESCRT-Ⅰ,ESCRT-Ⅱ,ESCRT-Ⅲ復(fù)合體蛋白[21]。

人體體液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要目的是尋找能夠幫助疾病早期診斷和治療干預(yù)的生物標(biāo)志物，但如何降低體液樣品的蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性、提高某些特殊病理生理狀態(tài)低密度蛋白的可檢測(cè)性，是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。血清或血漿蛋白質(zhì)組學(xué)一直是研究的焦點(diǎn)，而尿液作為疾病標(biāo)記物的來(lái)源具有無(wú)創(chuàng)和量大的優(yōu)點(diǎn)，比血漿的前景更誘人[22]。如從尿液中檢出的AQP2(一種跨膜蛋白)，可作為多種水平衡紊亂疾病(如糖尿病尿崩癥)的生物標(biāo)記物，然而其進(jìn)入尿液的機(jī)制在很長(zhǎng)一段時(shí)間尚不清楚[23,24]，Pisitun等[12]證實(shí)AQP2及其他一些頂部轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可借exosomes的釋放進(jìn)入尿液。多囊蛋白1(PD-1)和PD-2在常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用，這兩種蛋白在腎組織中含量低，不易檢測(cè)，而在尿液exosomes中易于檢出[12,21]。以上結(jié)果表明，通過(guò)尿液exosomes尋找高度敏感和特異性的生物標(biāo)記物，用于診斷腎臟疾病或監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)程具有較好的研究前景。

RNA生物標(biāo)記物的來(lái)源除了蛋白質(zhì)和肽類，尿液exosomes還含有mRNA，也可作為疾病的潛在生物學(xué)標(biāo)記物[25]。尿液中的核酸可能是由凋亡細(xì)胞釋放，不能代表有功能細(xì)胞的狀態(tài)[26,27]，不是可靠的生物標(biāo)志物，而尿液exosomes來(lái)源的RNA比尿液細(xì)胞來(lái)源的RNA更加穩(wěn)定。通過(guò)exosomes分離富集的RNA水平可增加其作為生物標(biāo)記物的敏感度和特異度。尿液exosomes成為獨(dú)特的RNA來(lái)源不僅由于它們的穩(wěn)定性和采集的非侵入性，其RNA還能代表腎臟系統(tǒng)的每個(gè)區(qū)段。Miranda等[25]從正常人尿液exosomes中提取RNA，通過(guò)RT-PCR分析鑒定了15種能代表腎單位和集合管不同區(qū)域的RNA，包括足細(xì)胞來(lái)源的podocin、近端小管來(lái)源的cubilin、集合管的AQP2。此外，研究者在V-ATPase B1敲除的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)尿液exosomes的mRNA，定量PCR分析與腎組織mRNA分析的結(jié)果相一致，進(jìn)一步支持了尿液exosomes來(lái)源的RNA分析在腎臟病理生理中的應(yīng)用[25]。

尿液exosomes研究的關(guān)鍵問題尿液exosomes可成為腎臟疾病的早期診斷和治療的標(biāo)記物，但該領(lǐng)域的研究存在一些亟需解決的問題，而尋找收集和儲(chǔ)存尿液exosomes的標(biāo)準(zhǔn)化方法則是關(guān)鍵。超速離心法是目前提取尿液exosomes最有效的方法，但其所需的昂貴設(shè)備難以在臨床實(shí)驗(yàn)室普及，并且耗時(shí)長(zhǎng)，不適于大規(guī)模樣本研究[19]。用超濾法獲得的exosomes常含有可溶性蛋白等雜質(zhì)，與exosomes一起競(jìng)爭(zhēng)LC-MS/MS的鑒定，導(dǎo)致特異度和敏感度下降[28]。去除Tamm-Horsfall蛋白(THP)的影響是有待解決的另一問題，腎臟每天分泌大量的THP，易于在尿液中形成巨大纖維聚集物，特別是低溫環(huán)境下這種聚集物能夠拖拽exosomes，在離心時(shí)阻礙其分離和純化，干擾質(zhì)譜或者免疫印跡的結(jié)果[19,29]。因此，exosomes需去除的尿液樣品中的THP，或者阻止其聚集。

Exosomes在腎臟疾病治療的前景

Exosomes已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療和免疫治療，而在腎臟疾病治療的研究才剛起步。已知間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)殘余腎臟固有細(xì)胞的再生、促進(jìn)急性腎損傷(AKI)的恢復(fù)，這種機(jī)制與旁分泌因子相關(guān)，而這些旁分泌因子具體有哪些尚不清楚。Bruno等[30]在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的exosomes能刺激腎小管上皮細(xì)胞的再生、抑制其凋亡，并通過(guò)體內(nèi)研究證實(shí)exosomes能夠促進(jìn)AKI模型小鼠小管上皮細(xì)胞的再生，加速形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的恢復(fù)，類似人間充質(zhì)干細(xì)胞直接使用的效應(yīng)。RNA酶能夠抑制前述體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)，提示這種生物學(xué)效應(yīng)與RNA相關(guān)。該研究者進(jìn)一步對(duì)exosomes提取的RNA進(jìn)行微陣列分析和定量PCR分析，證明exosomes能夠傳遞mRNA，這些mRNA與間充質(zhì)表型相關(guān)，參與翻譯的調(diào)控、增生和免疫調(diào)節(jié)。

以exosomes為基礎(chǔ)治療系統(tǒng)疾病相關(guān)的腎臟疾病的靶點(diǎn)在于內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞在血壓的調(diào)節(jié)、局部血流量的調(diào)節(jié)、血液凝固的調(diào)節(jié)、血脂的清除上起著非常重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與常見慢性病導(dǎo)致的腎臟疾病有密切關(guān)系，例如動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓，因此可以成為exosomes治療的潛在靶點(diǎn)[31]。

展 望

盡管exosomes具有疾病診斷生物標(biāo)志物和臨床治療干預(yù)的前景，但其在腎臟疾病方面的研究仍處于早期階段，尚需多方面、深層次的研究。我們期待能夠通過(guò)exosomes尋找到非侵入性的腎臟疾病診斷生物標(biāo)志物，并應(yīng)用于臨床。目前已經(jīng)有很多學(xué)者致力于尋找更有效的exosomes分離方法來(lái)替代經(jīng)典的超速離心法，使exosomes的蛋白和RNA等相關(guān)分析更加具有實(shí)用性和準(zhǔn)確性[28,32,33]。此外，exosomes能夠介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)(或信息)的傳遞，這一過(guò)程的干預(yù)和調(diào)控使exosomes應(yīng)用于腎臟疾病的治療成為可能。

1 Trams EG,Lauter CJ,Salem N Jr,et al.Exfoliation of membrane ecto-enzymes in the form of micro-vesicles.Biochim Biophys Acta,1981,645(1):63-70.

2 Johnstone RM,Adam M,Hammond JR,et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).J Biol Chem,1987,262(19):9412-9420.

3 Camussi G,Deregibus MC,Bruno S,et al.Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.Kidney Int,2010,78(9):838-848.

4 Johnstone RM.Exosomes biological significance:A concise review.Blood Cells Mol Dis,2006,36(2):315-321.

5 Futter CE,Pearse A,Hewlett LJ,et al.Multivesicular endosomes containing internalized EGF-EGF receptor complexes mature and then fuse directly with lysosomes.J Cell Biol,1996,132(6):1011-1023.

6 Kleijmeer M,Ramm G,Schuurhuis D,et al.Reorganization of multivesicular bodies regulates MHC class II antigen presentation by dendritic cells.J Cell Biol,2001,155(1):53-63.

7 van Niel G,Porto-Carreiro I,Simoes S,et al.Exosomes:a common pathway for a specialized function.J Biochem,2006,140(1):13-21.

8 Wollert T,Hurley JH.Molecular mechanism of multivesicular body biogenesis by ESCRT complexes.Nature,2010,464(7290):864-869.

9 Stoorvogel W,Kleijmeer MJ,Geuze HJ,et al.The biogenesis and functions of exosomes.Traffic,2002,3(5):321-330.

10 Théry C,Zitvogel L,Amigorena S.Exosomes:composition,biogenesis and function.Nat Rev Immunol,2002,2(8):569-579.

11 Wubbolts R,Leckie RS,Veenhuizen PT,et al.Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes.Potential implications for their function and multivesicular body formation.J Biol Chem,2003,278(13):10963-10972.

12 Pisitkun T,Shen RF,Knepper MA.Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(36):13368-13373.

13 Valadi H,Ekstr?m K,Bossios A,et al.Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.Nat Cell Biol,2007,9(6):654-659.

14 Mittelbrunn M,Gutiérrez-Vázquez C,Villarroya-Beltri C,et al.Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.Nat Commun,2011,2:282.

15 Zitvogel L,Regnault A,Lozier A,et al.Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine:dendritic cell-derived exosomes.Nat Med,1998,4(5):594-600.

16 Théry C,Regnault A,Garin J,et al.Molecular characterization of dendritic cell-derived exosomes.Selective accumulation of the heat shock protein hsc73.J Cell Biol,1999,147(3):599-610.

17 Chaput N,Schartz NE,Andre F,et al.Exosomes for immunotherapy of cancer.Adv Exp Med Biol,2003,532:215-221.

18 Morse MA,Garst J,Osada T,et al.A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer.J Transl Med,2005,3(1):9.

19 Zhou H,Yuen PS,Pisitkun T,et al.Collection,storage,preservation,and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.Kidney Int,2006,69(8):1471-1476.

20 Dimov I,Jankovic Velickovic L,Stefanovic V.Urinary exosomes.ScientificWorldJournal,2009,9:1107-1118.

21 Gonzales PA,Pisitkun T,Hoffert JD,et al.Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes.J Am Soc Nephrol,2009,20(2):363-379.

22 Gonzales P,Pisitkun T,Knepper MA.Urinary exosomes:is there a future? Nephrol Dial Transplant,2008,23(6):1799-1801.

23 Ishikawa SE,Schrier RW.Pathophysiological roles of arginine vasopressin and aquaporin-2 in impaired water excretion.Clin Endocrinol (Oxf),2003,58(1):1-17.

24 Kanno K,Sasaki S,Hirata Y,et al.Urinary excretion of aquaporin-2 in patients with diabetes insipidus.N Engl J Med,1995,332(23):1540-1545.

25 Miranda KC,Bond DT,McKee M,et al.Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease.Kidney Int,2010,78(2):191-199.

26 Cristaudo A,Vivaldi A,Guglielmi G,et al.A simple method to reveal possible ras mutations in DNA of urinary sediment cells.J Environ Pathol Toxicol Oncol,1997,16(2-3):201-204.

27 Botezatu I,Serdyuk O,Potapova G,et al.Genetic analysis of DNA excreted in urine:a new approach for detecting specific genomic DNA sequences from cells dying in an organism.Clin Chem,2000,46(8 Pt 1):1078-1084.

28 Cheruvanky A,Zhou H,Pisitkun T,et al.Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.Am J Physiol Renal Physiol,2007,292(5):F1657-F1661.

29 Pisitkun T,Johnstone R,Knepper MA.Discovery of urinary biomarkers.Mol Cell Proteomics,2006,5(10):1760-1771.

30 Bruno S,Grange C,Deregibus MC,et al.Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.J Am Soc Nephrol,2009,20(5):1053-1067.

31 van Balkom BW,Pisitkun T,Verhaar MC,et al.Exosomes and the kidney:prospects for diagnosis and therapy of renal diseases.Kidney Int,2011,80(11):1138-1145.

32 Merchant ML,Powell DW,Wilkey DW,et al.Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.Proteomics Clin Appl,2010,4(1):84-96.

33 Rood IM,Deegens JK,Merchant ML,et al.Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.Kidney Int,2010,78(8):810-816.