翟晚?xiàng)?張春水，高利生

（中國(guó)人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)系，北京 100038） （公安部物證鑒定中心，北京 100038）

高效液相色譜外標(biāo)工作曲線法測(cè)定大麻樹脂中四氫大麻酚含量的不確定度評(píng)定＊

翟晚?xiàng)?張春水，高利生

（中國(guó)人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)系，北京 100038） （公安部物證鑒定中心，北京 100038）

依據(jù)JJF 1059–1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，以檢測(cè)大麻樹脂中四氫大麻酚含量的實(shí)驗(yàn)為例，評(píng)定了采用高效液相色譜外標(biāo)工作曲線法進(jìn)行含量測(cè)定的不確定度。建立了高效色譜外標(biāo)工作曲線法測(cè)定樣品含量的數(shù)學(xué)模型，分析了不確定度的來(lái)源并給出了量化結(jié)果，合成擴(kuò)展不確定度為0.15%（k=2）。

高效液相色譜；外標(biāo)法；不確定度；大麻樹脂

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，在測(cè)量結(jié)果的完整表述中，應(yīng)包括測(cè)量不確定度［1］。當(dāng)前，在高效液相色譜領(lǐng)域，分析工作者進(jìn)行不確定度評(píng)定的定量方法主要集中于外標(biāo)單點(diǎn)定量法［2-5］。由于外標(biāo)工作曲線法測(cè)量不確定度的評(píng)定較為復(fù)雜，因此報(bào)道較少［6-7］。外標(biāo)工作曲線法與單點(diǎn)定量法相比，具有準(zhǔn)確、可靠等顯著優(yōu)勢(shì)，筆者以檢測(cè)大麻樹脂中四氫大麻酚含量實(shí)驗(yàn)為例，對(duì)采用高效液相色譜外標(biāo)工作曲線法的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行了不確定度評(píng)定和探討。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Prominenece UFLC型，附帶LC-20AD XR型泵、SIL-20AC XR型進(jìn)樣器、SPD-20A型檢測(cè)器、CTO-20AC 型柱溫箱、數(shù)據(jù)處理軟件LC solution，日本島津公司；

電子分析天平：XP105DR型，感量為0.01 mg，瑞典Mettler公司；

超聲振蕩器：KQ3200型，昆山市超聲儀器有限公司；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；

純水制備系統(tǒng)：Synergy UV型，美國(guó)Millipore公司；

移液槍：容量為100～1 000 μL，德國(guó)Eppendorf公司；

瓶口移液器：標(biāo)稱容量10 mL，德國(guó)Brand公司；

進(jìn)樣針：容量分別為50，100，250 μL，瑞士Hamilton公司；

四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)品：(100±0.5) μg／mL，美國(guó)Cerilliant公司；

大麻樹脂樣品：案件中收繳；

甲醇：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司；

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，由蒸餾水經(jīng)Millipore公司生產(chǎn)的Synergy UV型純水系統(tǒng)制備而得。

1.2 色譜條件

色譜柱：島津Inertsil ODS-SP柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水；梯度程序：以乙腈-水（體積比為70∶30）為初始流動(dòng)相，然后有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)以2%／min升至96%；柱溫：40℃；流速：1 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣品前處理

使用瑪瑙研缽將樣品研磨成粒度均勻的粉末，使用高精度天平等量稱取樣品粉末6份，分別裝入一次性試管中，用瓶口移液器加入20 mL（V1）甲醇，密封后以1 500 r／min振蕩10 min，離心5 min，用移液管移取1 mL（V2）上清液裝入一次性試管，再用瓶口移液器加入20 mL（V3）甲醇，搖勻后使用移液器移取約1.5 mL溶液裝入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中。

（2）四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.1 mg／mL）分別用甲醇稀釋成濃度分別為c1，c2，c3，c4，c5的標(biāo)準(zhǔn)使用液，供高效液相色譜儀分析（每種濃度進(jìn)樣3次），用最小二乘法建立外標(biāo)工作曲線。稀釋的具體過程如下：

使用注射器將安瓿瓶中1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)樣品全部吸取后注入容量瓶中，之后使用該注射器吸入稀釋溶劑甲醇潤(rùn)洗注射器和安瓿瓶，將剩余有效成分全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中，重復(fù)多次，定容至10 mL，配制成0.01 mg／mL（c1）的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

使用標(biāo)稱容量250 μL的微量進(jìn)樣針吸取0.01 mg／mL四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液500 μL（分兩次吸取），轉(zhuǎn)移至1 mL單標(biāo)線容量瓶中，定容，配制成0.005 mg／mL（c2）的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別使用不同標(biāo)稱容量的微量進(jìn)樣針吸取一定體積的0.01 mg／mL四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液，轉(zhuǎn)移至單標(biāo)線容量瓶中定容，分別配制成0.002，0.001，0.000 5 mg／mL（c3，c4，c5）的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（3）樣品測(cè)定

將高效液相色譜峰面積響應(yīng)值分別代入外標(biāo)工作曲線，得到對(duì)應(yīng)濃度的預(yù)估值并分別計(jì)算出6份樣品的含量，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。

2 不確定度來(lái)源分析

高效液相色譜（外標(biāo)工作曲線）法測(cè)定大麻樹脂中四氫大麻酚含量的數(shù)學(xué)模型：

式中：wi——單份樣品中四氫大麻酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

cpred——由工作曲線計(jì)算得到的單份樣品溶液的質(zhì)量濃度，mg／mL；

V1——溶解樣品時(shí)加入甲醇的體積，mL；

V2——從甲醇一次提取液中移取樣品溶液的體積，mL；

V3——稀釋時(shí)加入甲醇的體積，mL；

mi——單份樣品的質(zhì)量，mg；

n——樣品份數(shù)。

參照式(1)、式(2)，根據(jù)JJF 1059-1999［1］，高效液相色譜外標(biāo)法測(cè)定大麻樹脂中四氫大麻酚含量的測(cè)量不確定度主要來(lái)源于以下幾個(gè)方面：采用校準(zhǔn)工作曲線計(jì)算引入的不確定度（包括不同濃度的響應(yīng)值A(chǔ)的隨機(jī)變化、導(dǎo)致系列標(biāo)準(zhǔn)濃度賦值ci誤差的隨機(jī)效應(yīng)）、用于測(cè)定的樣品質(zhì)量m引入的不確定度（來(lái)源于天平稱量樣品的過程）、溶解樣品的溶劑體積V1引入不確定度、從甲醇一次提取液中移取V2體積的樣品溶液引入的不確定度、稀釋時(shí)加入的溶劑體積V3引入的不確定度、測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度urep（包括樣品不均勻性、技術(shù)人員個(gè)人熟練程度和其它因素引入的不確定度）。

3 不確定度分量的量化

3.1 應(yīng)用外標(biāo)工作曲線計(jì)算引入的不確定度u(c)

3.1.1 測(cè)量不同濃度的響應(yīng)值A(chǔ)的隨機(jī)變化引入的預(yù)估值cpred的不確定度u(cpred，A)

通常通過對(duì)若干對(duì)數(shù)值（c，A）的加權(quán)或未加權(quán)最小二乘法回歸來(lái)確定工作曲線A=ac+b中的常數(shù)a和b?？衫霉ぷ髑€通過樣品中被分析物產(chǎn)生的峰面積響應(yīng)值A(chǔ)obs計(jì)算出該分析樣品濃度cpred。

由于A的隨機(jī)變化引入的預(yù)估值cpred的不確定度可從工作曲線數(shù)據(jù)獲得，適用公式(3)［8］：

式中：var(cpred)——未加權(quán)數(shù)據(jù)預(yù)估值cpred的方差；

s——?dú)埐顦?biāo)準(zhǔn)偏差；

a——工作曲線斜率；

p——預(yù)估值點(diǎn)的進(jìn)樣次數(shù)，p=2；

n——工作曲線上各點(diǎn)測(cè)量次數(shù)之和，n=15；

b——工作曲線截距。

本實(shí)驗(yàn)建立的外標(biāo)法工作曲線方程為A=89 794 350c－3 337.032，預(yù)估值cpred=0.003 93 mg／mL，依據(jù)式(3)，(4)，測(cè)量不同濃度的響應(yīng)值A(chǔ)隨機(jī)變化引入預(yù)估值cpred的不確定度u(cpred，A) =3.05×10-5mg／mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(cpred，A) =u(cpred，A)／cpred=7.77×10-3。

3.1.2 工作曲線中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液賦值引入的不確定度u(cpred，c)

u(cpred，c)來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備過程及從標(biāo)準(zhǔn)溶液到標(biāo)準(zhǔn)工作液的稀釋過程。

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度

根據(jù)制造商說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)使用的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度c0=（100±0.5）μg／mL，服從矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(c0)=0.5／=0.289(μg／mL)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c0)=u(c0)／c0=0.002 89。

（2）移取標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

本實(shí)驗(yàn)中，除0.01 mg／mL濃度點(diǎn)使用注射器從標(biāo)準(zhǔn)樣品中取樣并稀釋，其余4種濃度的稀釋均使用微量進(jìn)樣針從0.01 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液中取樣。以c2=0.005 mg／mL濃度點(diǎn)為例，這一步驟引入的不確定度來(lái)自以下三個(gè)方面：微量進(jìn)樣針最大容量允差引入的不確定度；微量進(jìn)樣針排出溶液體積引入的不確定度；溫度變化引入的不確定度。

以使用250 μL進(jìn)樣針移取溶液為例：

本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)稱容量為250 μL的微量進(jìn)樣針已檢定合格，容量允差為±1.5%［9］。按照矩形分布，不確定度分量u250，1=1.5%×250／=2.165(μL)。

操作者將吸取的溶液排出微量進(jìn)樣針這一過程中，排出液體積的不確定度可通過多次測(cè)量的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)采用移取10次稱量得出的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為不確定度計(jì)算，u250，2=0.201 μL。

容量瓶在20℃校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室的溫度在(20±4)℃之間變動(dòng)。該影響引起的不確定度可通過計(jì)算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。由于液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需考慮前者即可。有機(jī)液體膨脹系數(shù)1.0×10-3／℃。因此，標(biāo)稱容量為V針的微量進(jìn)樣針產(chǎn)生的體積變化為±V針×4×1.0×10-3。按照矩形分布，u250,3=250

將3個(gè)不確定度分量合成，使用250 μL微量進(jìn)樣針移取標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=2.250 μL，相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u250，rel=u250／250=0.009 00。同理，可計(jì)算得到u100，rel=0.011 8，u50，rel=0.017 5。

（3）容量瓶定容引入的不確定度

使用容量瓶定容引入的不確定度來(lái)源于：

①校準(zhǔn)不確定度。檢定合格的1 mL A類單標(biāo)線容量瓶容量允差為±0.007 mL，10 mL A類單標(biāo)線容量瓶容量允差為±0.020 mL［10］。服從矩形分布，校準(zhǔn)不確定度由最大容量允差除以求得。

②充滿容量瓶至刻度的變化引起的不確定度?？赏ㄟ^充滿該容量瓶的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估，并直接作為不確定度進(jìn)行計(jì)算。10 mL A類單標(biāo)線容量瓶的重復(fù)性不確定度為0.006 41 mL，1 mL A類單標(biāo)線容量瓶的重復(fù)性不確定度為0.001 62 mL。

③溫度引起體積變化引入的不確定度。計(jì)算方法同3.1.2（2）。

將三個(gè)不確定度分量合成，計(jì)算得10 mL容量瓶定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u10，rel=0.002 66，同理，可計(jì)算得1 mL容量瓶定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel=0.004 93。

（4）引起標(biāo)準(zhǔn)濃度賦值ci誤差隨機(jī)效應(yīng)的合成

由標(biāo)準(zhǔn)值不確定度引起的預(yù)估值cpred的不確定度u(cpred，ci)近似值為u(ci)／n，n是用于校準(zhǔn)的ci值的數(shù)目（本實(shí)驗(yàn)n=5）［8］。

對(duì)于c1=0.01 mg／mL的濃度點(diǎn)，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度=3.93×10-5mg／mL，u(cpred，c1)=uc(c1)／n =7.86×10-6mg／mL。

c2，c3，c4，c5各濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)值ci=c1×吸取體積／定容體積。以c2=0.005 mg／mL濃度點(diǎn)為例，其相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc，rel(c2)=0.014 2，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(c2)=uc，rel(c2)×c2=7.10×10-5mg／mL，u(cpred，c2) =uc(c2)／n =1.42×10-5mg／mL。依此計(jì)算，得u(cpred，c3)，u(cpred，c4)，u(cpred，c5)分別為7.14×10-6, 2.68×10-6,1.86×10-6mg／mL，則導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)濃度賦值ci誤差的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(cpred，c)按式（5）計(jì)算：

將相關(guān)數(shù)據(jù)代入式（5）得u(cpred，c)=1.80×10-5mg／mL。

3.1.3 應(yīng)用工作曲線計(jì)算引入的不確定度合成

合成3.1.1與3.1.2節(jié)計(jì)算得到的兩個(gè)分量，得到用工作曲線計(jì)算引入的不確定度u(cpred)

3.2 稱量樣品引入的不確定度u(m)

本實(shí)驗(yàn)所用天平的計(jì)量證書標(biāo)明其稱量的最大允差為0.09 mg，稱量重復(fù)性（變動(dòng)性）為0.04 mg（依據(jù)天平校準(zhǔn)證書），包含因子k=，標(biāo)準(zhǔn)不確定度。凈重由兩次稱量操作所得（一次為皮重，另一次為毛重），每一次稱量均為獨(dú)立觀測(cè)結(jié)果，合成不確定度

3.3 樣品稀釋過程引入的不確定度

溶解樣品加入溶劑甲醇的體積V1、從甲醇一次提取液中移取V2體積的樣品溶液、再次稀釋加入的溶劑體積V3這三項(xiàng)引入的不確定度均源于移液器最大容量允許誤差、移液器排出體積的不確定性以及溫度變化這3個(gè)方面。合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算方法見3.1.2（2），計(jì)算結(jié)果見表1。

表1 各不確定度分量表

3.4 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度urep

在重復(fù)性條件下，對(duì)同一樣品從取樣開始重復(fù)測(cè)量n次，n次測(cè)定的平均值作為結(jié)果，則測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，計(jì)算結(jié)果見表1。

4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

將表1中各不確定度分量按式（6）合成，求得w的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc,rel(w)：

5 擴(kuò)展不確定度的計(jì)算及測(cè)量結(jié)果表示

95%置信概率下，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=k×uc(w)%=0.15%，樣品中四氫大麻酚的含量表示為(4.67±0.15)%，k=2。

6 結(jié)語(yǔ)

確定預(yù)估值cpred不確定度的標(biāo)準(zhǔn)方法有三種［8］：從計(jì)算所得的方差和協(xié)方差來(lái)獲??；從校準(zhǔn)數(shù)據(jù)獲取；從用來(lái)導(dǎo)出工作曲線的軟件提供的信息獲取。第一種方法計(jì)算繁瑣，第三種不具有普適性，而第二種方法不但方法相對(duì)簡(jiǎn)便可行，公式易于理解，而且通過引入殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差間接反映出線性相關(guān)系數(shù)的大小，使得不確定度的評(píng)定更加可靠，因此筆者認(rèn)為第二種方法為首選方法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用高效液相色譜外標(biāo)工作曲線法測(cè)定大麻樹脂中四氫大麻酚含量，測(cè)量結(jié)果的不確定度主要是由外標(biāo)工作曲線以及多份樣品的重復(fù)測(cè)量引起的，重復(fù)性誤差對(duì)小體積移液器或容量瓶影響較大，稀釋樣品步驟直接造成不確定度增大，采用較大體積的移液器和容量瓶可減小不確定度。

［1］ JJF 1059-1999 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示［S］.

［2］ 王威，倪春芳，張潤(rùn)生.高效液相色譜法測(cè)定海洛因含量的不確定度評(píng)定［J］.中國(guó)司法鑒定，2008(2): 28-30.

［3］ 屈穎. 布洛芬緩釋膠囊中布洛芬含量的測(cè)量不確定度評(píng)估［J］.天津藥學(xué)，2008，20(1): 8-10.

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［6］ 徐靖，汪歡晃，劉娟，等.超高效液相色譜法測(cè)定化妝品中孕激素的不確定度［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2008，18(3): 11-14.

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［8］ CNAS-GL06 化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南［S］.

［9］ JJG 196-2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］.

［10］ JJG 646-2006 移液器檢定規(guī)程［S］.

Uncertainty Evaluation of Determination of Tetrahydrocannabinol in Cannabis Resin by HPLC External Standard Working Curve Method

Zhai Wanfeng
（Department of Forensic Science， Chinese People’s Public Security University， Beijing 100038， China）
Zhang Chunshui， Gao Lisheng
（Institute of Forensic Science Ministry of Public Security P.R.C， Beijing 100038， China）

The determination uncertainty of tetrahydrocannabinol in cannabis resin by HPLC external standard working curve method was evaluated based on JJF 1059-1999 Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement. The mathematical models to evaluate the uncertainty of quantitative results of HPLC external standard working curve method were established, and each source and uncertainty component was analysized, and the combined expanded uncertainty was 0.15%(k=2).

HPLC; external standard method; uncertainty; cannabis resin

O657.7

：A

：1008-6145(2012)05-0008-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2012.05.002

*公安部重點(diǎn)研究計(jì)劃支持項(xiàng)目（2009ZDYJGAES024）;中國(guó)人民公安大學(xué)學(xué)科建設(shè)與研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（YX11120）

聯(lián)系人：翟晚?xiàng)鳎籈-mail: betty871211.student@sina.com

2012–07–22