張素軍，馮尚彩

蒺藜(Tribulus terrestris L.)為蒺藜科(Zygophyllaceae)一年生草本植物，其果實為傳統(tǒng)中藥，臨床上用于治療頭痛頭暈、目赤翳障、乳癰乳難、風(fēng)疹瘙癢等癥［1］。蒺藜含有的皂苷類成分是其重要的生理活性成分，除具有抗衰老、性強壯、抑癌等作用外，還具有降低空腹血糖的作用［2-4］。但蒺藜皂苷對餐后血糖的影響尚未見報道，本文對此進(jìn)行了研究，以期為蒺藜皂苷在餐后血糖控制中的作用機理和意義提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 蒺藜全草2010年8月采自山東省臨沂市，經(jīng)筆者鑒定為蒺藜科植物蒺藜(Tribulus terrestris L.)，曬干粉碎備用。

1.2 試劑及藥品 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，Merck公司);對-硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP，上海國藥化學(xué)試劑公司);四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司);阿卡波糖(Acarbose，北京拜爾醫(yī)藥保健有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990205);蒺藜皂苷(Saponins from Tribulus terrestris，STT)，參照褚書地［5］方法自制;葡萄糖酶法測定試劑盒，上?？菩郎锛夹g(shù)研究所;其他試劑除特別說明外，均為國產(chǎn)分析純;水為雙蒸水。

1.3 動物 清潔級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司動物中心(濟寧市)提供，許可證號 SCXK(魯)20050017。

1.4 儀器 BS210S電子天平(Sartorius)，RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞容生化儀器廠)，SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵(上海錦華層析設(shè)備廠)，ZK-82A型真空干燥器(上海實驗儀器總廠)，電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)，722分光光度計(上海市第三分析儀器廠)，TL-16R臺式高速冷凍離心機(上海市離心機機械研究所)，TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，WH-851型旋渦混合器(上海環(huán)球物化儀器廠)，玻璃勻漿器。

2 方法

2.1 STT對正常大鼠餐后血糖的影響 大鼠(240～250 g)隨機分為6組，每組9只，禁食12 h后，1～3組灌胃葡萄糖(2 g/kg)，同時分別灌胃蒸餾水(對照)、STT(100 mg/kg)和阿卡波糖(25 mg/kg);4～6組灌胃蔗糖(2 g/kg)，同時分別灌胃蒸餾水(對照)、STT(100 mg/kg)和阿卡波糖(25 mg/kg)。60min后尾靜脈采血，分離血清，用葡萄糖酶法測定試劑盒測定血糖濃度。

2.2 STT對2型糖尿病大鼠餐后血糖的影響大鼠(180±10)g飼喂高糖高脂飼料(由常規(guī)飼料加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇配制而成)4周后，腹腔注射四氧嘧啶(100 mg/kg)，繼續(xù)飼喂高脂高糖飼料 2周，禁食 12 h，灌胃葡萄糖(2 g/kg)，0、120min 后尾靜脈采血，酶法測定血糖濃度。選取0min血糖濃度≥7.0mmol/L而＜10mmol/L同時 120min血糖濃度≥11.1mmol/L而＜20mmol/L的為2型糖尿病模型鼠。糖尿病鼠隨機分為6組，每組8只，繼續(xù)飼喂高脂高糖飼料1周后，禁食12 h，1～3組灌胃葡萄糖(2 g/kg)，同時分別灌胃蒸餾水(對照)、STT(100 mg/kg)和阿卡波糖(25 mg/kg);4～6組灌胃蔗糖(2 g/kg)，同時分別灌胃蒸餾水(對照)、STT(100 mg/kg)和阿卡波糖(25 mg/kg)。60min后尾靜脈采血，分離血清，測定血糖濃度。

2.3 STT對α-葡萄糖苷酶活性的影響

2.3.1 大鼠小腸中α-葡萄糖苷酶的提取 正常雄性大鼠，乙醚麻醉，剖開腹腔，剪取十二指腸部分10 cm左右;剖開十二指腸，用冷的0.9%生理鹽水充分沖洗，然后用一干凈載玻片刮取小腸內(nèi)表面，將刮取物約按 1∶10(W/V)加入冷的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿，勻漿液 10000×g離心(4℃)30min，上清液于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)配置150μmol/L 的PNP，稀釋成100、75、50、30、15、0μmol/L。分別取上述 7 種不同濃度的PNP溶液各1mL，加入1mol/L Na2CO3溶液2mL，混勻，在400 nm下測定吸光度(A)，以A值為縱坐標(biāo)、PNP濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3 酶標(biāo)準(zhǔn)活性的測定 反應(yīng)體系［磷酸緩沖液(pH 6.8)0.1mol/L ，0.5mL;PNPG 5mmol/L，0.4mL;酶提取液0.1mL］在37℃溫育20min后，加入1mol/L Na2CO3溶液2mL終止反應(yīng)，混勻，以不加酶液為空白(緩沖液體積相應(yīng)增加)，在400 nm下測定吸光度(A)。

2.3.4 STT對α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定除反應(yīng)體系中分別加入10、1、0.1 mg/mL的STT溶液和0.1 mg/mL的阿卡波糖溶液0.1mL外(緩沖液體積相應(yīng)減少)，其他按照2.3.2項下進(jìn)行，測定400 nm下吸光度(A)。

2.3.5 酶活性抑制率的計算 1個α-葡萄糖苷酶活力單位(U)定義:pH 6.8、37℃時，1min釋放1μmol PNP的酶量。則酶活性抑制率(%):［酶標(biāo)準(zhǔn)活性(U)-抑制劑作用下酶活性(U)］/酶標(biāo)準(zhǔn)活性(U)×100%。

2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)以SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，并以Duncan檢驗進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果以表示。

圖1 正常大鼠一次性灌胃葡萄糖或蔗糖同時灌胃蒸餾水(對照)、阿卡波糖(25 mg/kg)或STT(100 mg/kg)60min后的血糖水平(，n=9)

圖2 2型糖尿病大鼠一次性灌胃葡萄糖或蔗糖同時灌胃蒸餾水(對照)、阿卡波糖(25 mg/kg)或STT(100 mg/kg)60min后的血糖水平(，n=8)

3 結(jié)果

3.1 STT對正常大鼠餐后血糖的影響 正常大鼠一次性灌胃蔗糖或葡萄糖同時灌胃STT、阿卡波糖和蒸餾水(對照)，60min后的血糖水平如圖1所示。STT顯著抑制灌胃蔗糖后血糖水平的升高，血糖水平為對照的70.19%(P＜0.001)，阿卡波糖使灌胃蔗糖后的血糖水平降為對照的72.62%(P＜0.001)。STT和阿卡波糖對灌胃葡萄糖后血糖水平的變化均無顯著影響(P＞0.05)。

3.2 STT對2型糖尿病大鼠餐后血糖的影響如圖2所示，STT和阿卡波糖均顯著抑制2型糖尿病大鼠一次性灌胃蔗糖后血糖水平的升高，60min后的血糖水平分別為對照的68.05%(P＜0.001)和61.90%(P＜0.001);STT和阿卡波糖對灌胃葡萄糖后血糖水平的變化均無顯著影響(P＞0.05)。

3.3 STT對α-葡萄糖苷酶活性的體外抑制作用如圖3所示，在0.1、1、10 mg/mL的 STT作用下，α-葡萄糖苷酶活性極顯著降低(P＜0.001)，其對酶活性的抑制率分別為20.83%、43.73%和52.62%，其中10 mg/mL的STT對酶活性的抑制作用與0.1 mg/mL阿卡波糖的抑制作用相當(dāng)，后者對酶的抑制率為51.94%。

圖3 STT和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用(，n=5)

4 討論

餐后高血糖是糖尿病特別是2型糖尿病的重要病理特征。流行病學(xué)調(diào)查表明，和空腹血糖相比，餐后血糖對2型糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展具有更大的相關(guān)性。有些個體雖然沒有明顯的糖尿病特征，但由于胰島素抵抗等原因，餐后血糖已顯著異常，有人稱之為“餐后糖尿病”。這種“餐后糖尿病”是動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的重要基礎(chǔ)，并最終加速和導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。因此，餐后高血糖的及時發(fā)現(xiàn)和有效控制，對糖尿病特別是2型糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防和治療具有極其重要的作用［6-9］。α-葡萄糖苷酶位于小腸黏膜上皮，是糖類物質(zhì)消化和吸收的關(guān)鍵酶，能夠水解蔗糖、麥芽糖等寡糖類的α-糖苷鍵，最終產(chǎn)生可被吸收的單糖［10］;α-葡萄糖苷酶抑制劑，如已廣泛應(yīng)用于臨床的阿卡波糖［11］，通過對該酶的抑制作用，延遲和降低糖類物質(zhì)的消化和吸收，從而有效降低餐后血糖水平，在2型糖尿病的治療中發(fā)揮重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，從中藥蒺藜全草中提取的蒺藜皂苷-STT與卡波糖一樣，不僅能夠顯著降低正常大鼠灌胃蔗糖后血糖水平的升高(圖1)，而且能夠顯著降低2型糖尿病大鼠灌胃蔗糖后的血糖水平的升高(圖2)。同時，STT與阿卡波糖對正常和2型糖尿病大鼠灌胃葡萄糖后的血糖變化均無顯著性影響(圖1、圖2)。鑒于STT對餐后血糖的影響與阿卡波糖的作用具有較大的一致性，推測其對餐后血糖水平的影響也是通過對α-葡萄糖苷酶的抑制而發(fā)揮作用的。進(jìn)一步體外實驗發(fā)現(xiàn)(圖3)，STT劑量依賴性地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，10 mg/mL的STT即使酶的活性抑制50%以上，與0.1 mg/mL阿卡波糖的作用相當(dāng)。表明STT對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用有效降低了正常和糖尿病大鼠餐后血糖的升高，為其在2型糖尿病中的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了實驗證據(jù)。至于STT對α-葡萄糖苷酶作用的確切分子機理和具體作用物質(zhì)，尚需從生物、化學(xué)和藥理等方面做進(jìn)一步研究。

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