王會(huì)玲 周曉春 馬春虎 王 冰 王曉民

(1.承德醫(yī)學(xué)院生理教研室，河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000;3.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069)

AD是一種多發(fā)于中老年期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)沉積激活膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)的腦內(nèi)炎性反應(yīng)，在AD的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，而抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物具有神經(jīng)保護(hù)作用。雷公藤在我國(guó)已有上千年的藥用歷史，其抗炎免疫有效組分雷公藤多甙在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等炎性、變態(tài)性、自身免疫性疾病等方面已取得肯定效果［1］。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，T10)是從雷公藤中提取的小分子單體活性成分，其主要藥理活性為抗炎和免疫抑制。通常，小膠質(zhì)細(xì)胞維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，但其過度激活可導(dǎo)致或加重神經(jīng)元損傷，從而參與多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。近年來(lái)，研究［2］顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子及活性氧產(chǎn)物，從而在AD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本研究通過觀察T10對(duì)AD細(xì)胞模型中小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)及NO釋放的影響，以期闡明小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在AD病變中的作用，并希望為AD的天然藥物治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1)藥物與試劑:雷公藤內(nèi)酯醇(T10)由北京大學(xué)藥學(xué)院屠鵬飛教授提供。Griess試劑為瑞典Fluka公司產(chǎn)品，抗iNOS抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品，Aβ1-42由美國(guó)多肽公司生產(chǎn)。

2)主要儀器:超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備廠)、恒溫?fù)u床(德國(guó)HEIDOLPH)、超低溫冰箱(德國(guó)NUAIR)、CO2孵箱(SANYO)、酶標(biāo)儀(美國(guó) BIO-RAD)。

1.2 方法

1)小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng):SD乳鼠在出生24 h之內(nèi)斷頭取腦，剝離軟腦膜和血管，用Pasteur滴管輕輕吹打至組織塊完全消散，離心5 min(1 000 r/min)，按每瓶1.5只腦(10 mL)的密度將細(xì)胞懸液接種到Poly-D-lysine處理過的75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后更換含血清培養(yǎng)基，以后每3 d半量換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)到第14天時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫?fù)u床，180 r/min震搖2 h，取上清液，離心10 min(1 000 r/min)，細(xì)胞用含血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL。將細(xì)胞接種于Poly-D-lysine處理過的孔板或培養(yǎng)皿中，穩(wěn)定24 h后用于試驗(yàn)。

2)細(xì)胞存活率測(cè)定:將小膠質(zhì)細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為(5×105/mL)，每孔接種體積為200 μL。細(xì)胞穩(wěn)定24～72 h后加入藥物處理，藥物處理至相應(yīng)時(shí)間后，移去培養(yǎng)液，加入0.5 g/L MTT溶液，100 μL/孔，孵育4 ～6 h;加入助溶劑100 μL/孔，孵育 6 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)藍(lán)色甲瓚的生成量，檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm。

3)細(xì)胞上清NO的測(cè)定:依據(jù)Griess反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)為540 nm，參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

4)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的測(cè)定:細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板，給予相應(yīng)處理后棄去培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白，7.5%SDS-PAGE分離后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉膜2 h，抗iNOS(1:500)抗體4℃孵育過夜，TBST充分洗滌膜后用二抗(羊抗鼠IgG/HRP，1:1 000)室溫孵育1 h，ECL試劑顯色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用凝膠圖像分析儀拍攝照片后，軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶(β-actin)的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用Prism4.0版軟件進(jìn)行，多組計(jì)量數(shù)據(jù)間均數(shù)比較用單因素方差分析(ANOVAs)和Newman-Keuls檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T10對(duì)Aβ1-42激活小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

2.2.1 T10對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的T10分別與小膠質(zhì)細(xì)胞共孵育24 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，其結(jié)果如圖1。由圖可知，10-11～10-8mol/L T10對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞均未見明顯的毒性作用，而10-7mol/L T10會(huì)使小膠質(zhì)細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.05)。

圖1 T10對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of T10 on survival rate of microglia*P ＜0.05 vs control group;T10:triptolide.

2.2.2 T10對(duì)Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO的影響

用不同濃度的T10預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞12 h，然后加入10 μmol/L Aβ1-42共孵育12 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，Griess反應(yīng)檢測(cè)NO的含量。結(jié)果顯示:10 μmol/L Aβ1-42可使小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO明顯增加(P＜0.01)，而10-11～ 10-8mol/L 的 T10 均可抑制 10 μmol/L Aβ1-42所誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞 NO的釋放(P＜0.01)(圖2)。

2.2.3 T10對(duì) Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞 iNOS表達(dá)的影響

Western blotting的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ組iNOS條帶比對(duì)照組明顯增粗，Aβ1-42可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)iNOS明顯增加(P＜0.01)，10-11～10-8mol/L的 T10可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS表達(dá)增加(P＜0.05)(圖3)。

圖2 T10對(duì)Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO的影響Fig.2 Effects of T10 on Aβ1-42induced release of NO from microglia

圖3 T10對(duì)Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響Fig.3 Effects of T10 on Aβ1-42induced expression of iNOS from microglia

3 討論

Aβ沉積引起的腦內(nèi)炎性反應(yīng)是AD最重要的致病原因之一。棲居于腦內(nèi)的免疫細(xì)胞，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［2］，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，從而損害神經(jīng)元。退變死亡的神經(jīng)元碎片及有毒物質(zhì)反過來(lái)又刺激其他膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎性細(xì)胞因子。這樣在腦內(nèi)就形成一個(gè)不斷增強(qiáng)的自身毒性環(huán)路，使炎性反應(yīng)不斷加強(qiáng)，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)癡呆癥狀。

NO［3］具有雙重活性:一方面作為特殊神經(jīng)遞質(zhì)參與突觸可塑、神經(jīng)元發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶和行為等眾多生理機(jī)制;另一方面，過量的NO可通過氧化應(yīng)激、破壞能量代謝過程中的多種酶類減少ATP生成、損傷膜性結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)及DNA，導(dǎo)致神經(jīng)元壞死或凋亡等從而損傷神經(jīng)系統(tǒng)。目前普遍認(rèn)為，由于NO釋放過量，它在AD中的神經(jīng)毒性作用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其保護(hù)作用。

NO作為氧自由基的一種，大量的證據(jù)［4-6］表明它的神經(jīng)毒性在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中起重要的作用。NO可刺激 NMDA受體(一種興奮性氨基酸受體)產(chǎn)生谷氨酸，直接殺傷培養(yǎng)的人類胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元，并能使少突膠質(zhì)細(xì)胞溶解;高濃度的NO還可透過細(xì)胞膜、線粒體膜，修飾某些蛋白質(zhì)的巰基、血紅素輔基及鐵硫中心，從而抑制線粒體呼吸鏈各種復(fù)合體的活力;NO與超氧陰離子 (O-2)發(fā)生快速反應(yīng)，生成強(qiáng)氧化性的過氧化亞硝基 (peroxynitrite，ONOO-)，而引起蛋白質(zhì)、類脂質(zhì)及DNA氧化，或分解轉(zhuǎn)化為OH-自由基，對(duì)細(xì)胞造成不可逆的氧化損傷［7-8］。

iNOS是一種誘導(dǎo)酶，正常無(wú)表達(dá)，但在病理?xiàng)l件下可不依賴Ca2+/CaM表達(dá)。iNOS一旦表達(dá)其活性便可持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，從而大量、持續(xù)產(chǎn)生NO，介導(dǎo)廣泛的毒性作用。本研究證實(shí):在Aβ1-42作用下NO的釋放明顯增加，與iNOS的表達(dá)增加相對(duì)應(yīng)。

T10是我國(guó)傳統(tǒng)中藥雷公藤的主要藥理活性成分之一。本研究室前期研究［9-11］發(fā)現(xiàn)，T10在 PD炎性反應(yīng)模型上具有明確的抗炎作用，能夠抑制LPS引起的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎性因子的釋放，從而改善PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)行為。為探討T10在Aβ1-42激活膠質(zhì)細(xì)胞的AD炎性反應(yīng)模型上是否同樣具有抗炎活性，我們選用不同濃度T10預(yù)孵育小膠質(zhì)細(xì)胞12 h，然后加入 10 μmol/L Aβ1-42共同作用 12 h，檢測(cè)了細(xì)胞上清中NO的含量及小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):T10可明顯拮抗Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放及iNOS的表達(dá)。

在此基礎(chǔ)上，我們還想進(jìn)一步探索以下問題:①T10抗炎作用的具體機(jī)制。iNOS的表達(dá)受NF-κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，T10拮抗Aβ1-42引起小膠質(zhì)細(xì)胞激活的分子機(jī)制是否與抑制NF-κB的活性有關(guān)?②T10除了通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化而保護(hù)神經(jīng)元外，是否可促進(jìn)神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用?

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