丁 磊 高 宏 朱煜冰 李文斌

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院腫瘤外科，北京 100038;2.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院腫瘤內科，北京 100038)

Claudins家族蛋白是細胞間緊密連接蛋白的主要結構之一，其表達具有組織特異性，在維持腸上皮細胞極性和緊密連接屏障功能方面起著重要作用。為研究該家族基因Claudin-7在腸道中的功能和在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究構建Claudin-7基因敲除小鼠模型并初步分析Claudin-7為可能的大腸癌抑癌基因。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和小鼠

小鼠飼養(yǎng)在SPF級動物房(美國東卡大學布羅迪醫(yī)學院動物中心提供)，兔抗Cox-2多抗，intergrin α2多抗購自美國Cell signaling公司，兔抗Claudin-7單抗購自日本IBL公司;鼠抗GAPDH單抗購自美國Calbiochem公司;抗兔和抗鼠辣根過氧化酶標記的二抗購自美國Promega公司。

1.2 PCR反應體系

取少許小鼠尾組織溶解在TENs緩沖液(50 mmol/L TRis，0.4 mol/L NaCl，100 mmol/L EDTA，0.5%SDS)55℃水浴5h，6 mol/L NaCl充分溶解，離心取上清加95%乙醇輕柔反復混勻溶解，離心后70%冷乙醇洗滌所得即是小鼠基因DNA;PCR引物為:2.5 kb:5'-CTGCAGAGTGAGATCCTGTCTCAAAAGTAC-3';3'-CGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAG-5';5.7 kb:5'-CAACTCGGGCCTGCAACTGCTG-3'，3'-GCAAGCCATAGCACACGCACACCATGGGAC-5';PCR反應體系:5.7 kb片段:10×LA PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.5 μL，Takara LA Taq 0.2 μL，Advantage 2 PCR polymerase 0.2 μL，PCR primer各1 μL，最終反應體系25 μL;94℃變性10 min，94℃變性30s，68℃退火6 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min;2.5 kb 片段:10 ×LA PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.5 μL，Takara LA Taq 0.2 μL，Advantage 2 PCR polymerase 0.2 μL，PCR primer各 1 μL，最終反應體系25 μL;94℃變性10 min，94℃變性30s，68℃退火3 min共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3 蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色

腸道制作成圈狀，10%甲醛浸泡，制作5 μm石蠟組織切片，二甲苯脫蠟5 min 2次，梯度乙醇脫水，蘇木素浸潤6 min，自來水沖洗，1%乙酸1s，1%碳酸鋰1s，自來水沖洗10 min，80%乙醇2 min，酸性紅1 min，乙醇醇化，最后Hemo-De再脫蠟2 min 2次，封片，光學顯微鏡下觀察。

1.4 免疫共沉淀技術

腸道組織裂解液加入intergrin α2抗體，4℃緩慢搖晃孵育過夜;將預處理過的10 μL protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4℃緩慢搖晃孵育2～4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連;免疫沉淀反應后，在4℃以3 000 r/min速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底，將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 mL裂解緩沖液洗3～4次，最后加入15 μL的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，以下同蛋白質印跡技術測定Claudin-7表達。

1.5 蛋白質印跡技術

(RIPA)buffer(10%SDS，4 mol/L NaCl，10%DOC，0.5 mol/L EDTA，100 mmol/L Na Pyrophosphate，0.5mol/L NaF， 10% TX-100， 1mol/L HEPES)提取腸道組織蛋白，BCA方法測定蛋白濃度，SDS-PAGE膠行蛋白分離，凝膠轉移到硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗兔抗Claudin-7、Cox-2、C-jun和C-fos 4℃孵育過夜，2.5%脫脂牛奶漂洗，辣根過氧化酶標記的二抗羊抗兔孵育常溫1 h，TBS/Tween漂洗3次，每次15 min，增強化學發(fā)光法ECL發(fā)光，膠片顯影、定影。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠形態(tài)及PCR基因鑒定情況

小鼠出生后6 d形態(tài)，Claudin-7基因敲除小鼠表現(xiàn)為形體明顯縮小，伴脫水現(xiàn)象(圖1A)，野生型小鼠體質量為(3.73±0.12)g，Claudin-7基因敲除小鼠體質量為(1.28±0.14)g;兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=12.53，P＜0.001);Claudin-7基因敲除小鼠腸道內可見明顯腔內出血及腸內容物變稀(箭頭所指，圖1 C);基因型鑒定只擴增出5.7 kb條帶者為野生型小鼠，而只有2.5 kb條帶者為基因敲除小鼠(圖1 B)。

2.2 HE染色結果

Claudin-7基因敲除小鼠腸道上皮細胞可見廣泛脫落，細胞極性的喪失，空泡形成，而野生型小鼠腸黏膜上皮細胞形態(tài)規(guī)則(圖2 A);其他組織如胃、肺、膀胱、皮膚、胸腺、腎臟組織中未見明顯組織破壞(圖2 B);

圖1 Claudin-7基因敲除小鼠鑒定與形態(tài)Fig.1 Identification and morphology of Claudin-7 knockout mice

圖2 Claudin-7基因敲除小鼠在不同器官病理變化(HE染色)Fig.2 Pathological changes in different organs of WT and KO mouse(HE staining).

2.3 免疫共沉淀結果

用intergrin α2抗體自腸道組織中沉淀intergrin α2蛋白后，在野生型小鼠腸道組織中可檢測到Claudin-7蛋白，說明兩種蛋白之間存在相互作用(圖3)。

2.4 蛋白印跡結果

Claudin-7在各臟器中的表達:Claudin-7在腸道(小腸和大腸)中均勻表達(圖4 A)，同時在胃、肺、膀胱、皮膚、胸腺、腎臟等臟器中均有表達(圖4 C)，在心臟、肝臟、腦組織未見表達(圖4 B)。C-jun、C-fos及Cox-2蛋白在Claudin-7基因敲除小鼠大腸和小腸中表達顯著升高(P＜0.001)(表1、表2，圖5A)。對人類大腸癌相關組織Claudin-7蛋白檢測顯示Claudin-7在大腸癌組織中表達明顯降低，隨分化程度降低表達亦明顯降低，在大腸癌肝轉移組織中表達幾乎喪失，蛋白表達相對值在正常大腸組織、高分化大腸癌組織、低分化大腸癌組織及大腸癌肝轉移組織中分別為0.982 ±0.001、0.275 ±0.001、0.015 ±0.000、0.010 ±0.000;組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=35.4，P＜0.001)(圖5B)。

圖3 免疫共沉淀結果Fig.3 Results of immunopreciptation

圖4 Claudin-7在不同組織、器官表達Fig.4 Claudin-7 expression in different tissues and organs detected with Western blotting method

表1 C-fos、C-jun和Cox-2蛋白在Claudin-7基因敲除和野生型小鼠大腸中的表達Tab.1 Expression level of C-fos，C-jun and Cox-2 protein in large intestine of Claudin-7 gene knockout and wildtype mouse

表2 C-fos、C-jun和Cox-2蛋白在基因敲除和野生型小鼠小腸中的表達Tab.2 Expression level of C-fos，C-jun and Cox-2 protein in small intestine of Claudin-7 gene knockout and wildtype mouse

圖5 Western blotting檢測結果Fig.5 Results of Western blotting detection

3 討論

緊密連接蛋白對維持正常上皮、內皮細胞的生理功能有著很重要的作用，這些蛋白質包括Occludin、Claudins家族、連接黏附分子(JAM)、PDZ表達蛋白如ZO-1、ZO-2、ZO-3 等。自從 1998 年，F(xiàn)uruse M［1］鑒定第一個Claudin分子以來，已有24個Claudin家族成員被識別。目前為止已有多篇關于緊密連接蛋白家族基因敲除小鼠模型的報道［2-11］:Claudin-1基因敲除小鼠表現(xiàn)為皮膚屏障障礙，出現(xiàn)明顯脫水，出生后1 d死亡;Claudin-5基因敲除表現(xiàn)為血腦脊液屏障功能障礙，出生后當天死亡;Claudin-11基因敲除表現(xiàn)為血睪屏障障礙和神經系統(tǒng)髓鞘變性，出現(xiàn)耳聾;Claudin-14基因突變引起常染色體隱性耳聾;Claudin-16的基因突變會引起家族性、伴發(fā)高尿鈣和腎臟鈣質沉著的低鎂血癥，可以進行性導致慢性腎功能不全;Claudin-19基因敲除表現(xiàn)為雪旺細胞功能障礙;Occludin基因敲除表現(xiàn)為復雜的表型如出生后生長遲緩，基因敲除的雌性小鼠拒絕哺乳，雄性小鼠無生育能力，但能長久生存;ZO-1和ZO-2基因敲除表現(xiàn)為胚胎期死亡，ZO-3基因敲除無表型;JAM-A基因敲除表現(xiàn)出大腸上皮細胞通透性的改變和炎性反應的發(fā)生，但能長期生存，JAM-C完全敲除的小鼠模型體內沒有成熟精子產生;Claudin-15基因敲除的小鼠出生2月后表現(xiàn)為近端小腸直徑較正常小鼠大2倍，但能長期生存;從以上結果可以看出由于不同緊密連接蛋白的組織特異性，不同的基因突變后均出現(xiàn)迥異的表型，體現(xiàn)了各種不同緊密連接蛋白特殊的生理作用。本課題組為研究Claudin-7在機體當中的作用和在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中潛在的功能，首次構建了Claudin-7基因敲除小鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)小鼠出生時表現(xiàn)正常，但出生后4 d左右即停止生長，7 d左右死亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)小腸和大腸黏膜表現(xiàn)出嚴重的結構破壞并伴有明顯的炎性反應增生現(xiàn)象，顯示出Claudin-7在維持腸道上皮細胞功能中有重要意義。

為進一步研究Claudin-7在機體當中的作用，本研究首先檢測了各臟器Claudin-7蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)Claudin-7在腸道中均勻表達，并且發(fā)現(xiàn)Claudin-7蛋白強表達且位于腸上皮細胞的頂端、側面和基底部，不同于其他緊密連接蛋白只位于腸上皮細胞的頂端;體現(xiàn)了Claudin-7蛋白位置的特殊性，同時研究中還發(fā)現(xiàn)Claudin-7在胃、肺、腎臟、膀胱、皮膚、胸腺等臟器當中亦有表達;為此我們對表達Claudin-7的組織進行常規(guī)病理檢查，結果發(fā)現(xiàn)只有腸道表現(xiàn)出顯著的病理變化包括上皮細胞的嚴重脫落、細胞內空泡形成、極性喪失和明顯的炎性反應增生現(xiàn)象;其他臟器除少許中性粒細胞浸潤外未見明顯的病理變化。結合基因敲除小鼠在出生后的生長情況，考慮小鼠的死亡與腸道吸收營養(yǎng)障礙有密切關系，同時表明Claudin-7并未影響小鼠的胚胎發(fā)育，很有可能是該基因敲除后影響到相關蛋白的表達或功能從而導致上皮細胞嚴重的免疫炎性反應，導致細胞的形態(tài)、功能變化。

為進一步探討Claudin-7在機體中發(fā)揮作用的機制，本研究應用MicroArray初步篩選發(fā)現(xiàn)Claudin-7與基底膜蛋白intergrin α2存在相關性，于是采用免疫共沉淀技術進一步驗證發(fā)現(xiàn)Claudin-7與intergrin α2蛋白免疫共沉淀，說明兩者之間存在相互作用，同時免疫印跡顯示C-jun、C-fos、Cox-2蛋白在Claudin-7基因敲除小鼠腸道中表達顯著升高。整合素(integrin)是細胞表面重要的黏附分子受體，介導許多信號通路的發(fā)生，其中Integrin/FAK信號傳導通路，在Integrin介導的腫瘤黏附轉移信號轉導通路中起著至關重要的作用;同時本研究發(fā)現(xiàn)FAK和P-FAK蛋白在Claudin-7基因敲除小鼠腸道中顯著高表達，說明有可能是Claudin-7表達缺失和intergrin α2相互作用激活了下游基因FAK通路，從而激活由C-jun和C-fos形成的核轉錄因子AP-1(資料未發(fā)表)，促進了潛在癌基因Cox-2蛋白的高表達，可能進一步誘導腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近年來，國外諸多研究［12］表明，Cox-2參與了多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，尤其與結直腸癌(CRC)等消化道腫瘤關系密切，其將成為消化道腫瘤防治研究的一個新靶點。

為進一步證明Claudin-7在大腸癌中潛在的抑癌功能，本研究應用蛋白印跡技術分別就Claudin-7蛋白在正常腸組織和不同分化大腸癌及肝轉移組織中的表達進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)Claudin-7蛋白的表達隨癌組織分化程度的降低而逐漸減弱，而在腸癌肝轉移組織中表達明顯降低，初步顯示了Claudin-7可能在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展方面起到潛在的抑癌作用。

Claudin-7基因敲除小鼠的建立提供了較好的小鼠腸道炎性反應性疾病模型，為研究炎性反應相關性結腸癌的發(fā)生、發(fā)展提供了良好的平臺。

致謝:在此特別感謝美國東卡大學布羅迪醫(yī)學院陳艷華教授給予動物模型建立支持和技術指導。

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