國(guó)海東,邵水金,朱晶,陸萍萍

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電針對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶力改善及海馬神經(jīng)元損傷保護(hù)的作用及機(jī)制

國(guó)海東,邵水金,朱晶,陸萍萍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室,上海 201203)

探討電針保護(hù)海馬神經(jīng)元和改善阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)大鼠學(xué)習(xí)記憶力的作用機(jī)制。將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和電針組,采用Morris水迷宮檢測(cè)空間學(xué)習(xí)和記憶能力的變化。Hoechest33342染色觀察各組海馬神經(jīng)元的凋亡;Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax的水平;免疫組織化學(xué)染色分析Caspase-3陽性神經(jīng)元的個(gè)數(shù)和光密度值。電針治療可明顯提高AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能,并可降低海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞的數(shù)目、上調(diào)Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)Bax和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)。電針可通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的平衡比值,降低Caspase-3的表達(dá),對(duì)抗b-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,改善AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能。

針刺療法;電針;阿爾茨海默病;大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種漸進(jìn)性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性變性病,以進(jìn)行性記憶障礙、全面智能減退、個(gè)性改變以及精神行為異常為主要臨床表現(xiàn),給患者、患者家屬以及整個(gè)社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。AD已是繼心血管疾病和腫瘤之后的老年人死亡的第三大病因[1]。在病理學(xué)上,AD以細(xì)胞外b-淀粉樣蛋白(amyloid-b,Ab)沉積形成的老年斑、細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元及其突觸的缺失為典型特征,膽堿能神經(jīng)元的丟失是引起進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能減退的根本原因。由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)本病的發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制尚未充分闡明,相關(guān)治療藥物缺乏很好的特異性,臨床療效十分有限[2]。中醫(yī)學(xué)對(duì)AD的病理論述較為豐富[3]。針對(duì)AD復(fù)雜的多因素致病,中醫(yī)針灸治療具有多層面、多途徑、多靶點(diǎn)作用的優(yōu)勢(shì)[4]。目前,諸多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究顯示,中醫(yī)針灸具有較好地治療AD的作用[4]。然而,針灸治療對(duì)AD的具體作用機(jī)制目前尚不十分清楚。本研究在構(gòu)建AD大鼠模型的基礎(chǔ)上,采用電針治療,繼而從行為學(xué)、組織病理學(xué)與分子生物學(xué)等多方面探討電針保護(hù)海馬神經(jīng)元和改善學(xué)習(xí)記憶力的作用機(jī)制,以期為AD的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

SPF級(jí)SD大鼠,體重(200±50)g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;Ab1-40購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;兔抗大鼠Bcl-2/Bax多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-3單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;Hoechest33342染色購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;SABC試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vector公司;生物素化山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research公司;立體定位儀(江灣Ⅰ型)為第二軍醫(yī)大學(xué)生理教研室研制;Morris水迷宮為中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)研究院研制。

1.2 AD動(dòng)物模型建立

10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,將頭顱固定在腦立體定位儀上,消毒手術(shù)區(qū)皮膚,做正中切口暴露前囟,參照大鼠腦立體定位圖譜,以前囟為原點(diǎn),向后3.5 mm,旁開2.0 mm為鉆孔點(diǎn),鉆開左右兩個(gè)對(duì)稱的小孔,自腦顱骨表面進(jìn)針3.0 mm至海馬,用微量進(jìn)樣器抽取2ml(10mg)Ab1-40(37℃孵育1星期,使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)[5]),每點(diǎn)注射lml(5mg),緩慢進(jìn)針,5 min內(nèi)注射完畢,注射完畢后停針5 min,緩慢拔針,縫合皮膚,術(shù)后肌肉注射青霉素,連續(xù)3 d,以防感染。假手術(shù)組注射等量生理鹽水。

1.3 分組及治療

7 d傷口完全愈合后,飲食正常,無肢體殘疾,即開始治療。實(shí)驗(yàn)分正常組、假手術(shù)組、模型組和電針組4組,每組20只。在電針組,取百會(huì)(頂骨正中)和涌泉(于大鼠足底大趾與次趾之間向后2 mm處),采用0.35 mm×13 mm不銹鋼毫針,百會(huì)穴平刺約2.5 mm;涌泉穴直刺進(jìn)針1.5 mm;連接G6805A型電針治療儀,選擇連續(xù)波,頻率為20 Hz,強(qiáng)度以肢體抖動(dòng),且大鼠能安靜耐受為度。針刺治療每天1次,每次30 min,7 d為1個(gè)療程,療程間休息1 d,共治療4個(gè)療程。正常組、假手術(shù)組及模型組正常飼養(yǎng),不予電針治療。

1.4 空間學(xué)習(xí)記憶力測(cè)試

采用Morris水迷宮測(cè)試大鼠逃避潛伏期和通過原平臺(tái)次數(shù)以檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的變化[6]。歷時(shí)5 d,每天分別從2個(gè)不同的入水點(diǎn)將大鼠放入迷宮中,記錄其70 s內(nèi)尋找平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)。若大鼠入水后70 s內(nèi)未能找到平臺(tái),則將其置于平臺(tái)上并停留20 s,引導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶,逃避潛伏期記錄為70 s。實(shí)驗(yàn)第6天撤除平臺(tái),將大鼠面向池壁從任一入水點(diǎn)放入水池,測(cè)試70 s內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)。Morris水迷宮測(cè)試期間仍按2.2部分對(duì)大鼠進(jìn)行治療處理。

1.5 Hoechest33342染色

Morris水迷宮測(cè)試完成后,部分動(dòng)物經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉,打開腹腔,暴露心臟,將注射針頭插入左心室,剪開右心耳,快速灌注4℃生理鹽水,待右心耳處流出澄清液體,換4℃多聚甲醛灌注到大鼠四肢強(qiáng)直,快速斷頭取腦。將腦組織置于4%多聚甲醛中固定24 h,然后進(jìn)行乙醇系列脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋。所有標(biāo)本均以注射點(diǎn)為中心做連續(xù)冠狀切片,片厚5mm,所有切片均包含海馬區(qū)。取各組切片,脫蠟、水化后,滴加Hoechest33342染色液,室溫染色10 min,在熒光顯微鏡下觀察各組海馬神經(jīng)元的凋亡情況。

1.6 Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax的水平

部分動(dòng)物頸椎脫臼處死,快速取出海馬組織,加入RIPA buffer裂解液,提取總蛋白。按常規(guī)方法灌制聚丙烯酰胺凝膠,微量加樣器加樣后電泳。在半干轉(zhuǎn)印儀上轉(zhuǎn)膜30 min。取出PVDF膜,封閉液封閉2 h。倒掉封閉液,分別與一抗、二抗孵育,同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參照。免疫印跡化學(xué)發(fā)光顯色,X片曝光,洗片。將膠片進(jìn)行掃描,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析,計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量,方法為待測(cè)蛋白質(zhì)的凈像素值/GADPH的凈像素。

1.7 Caspase-3染色組織化學(xué)染色

取各組切片,脫蠟、水化后,3%H2O2滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水洗滌,微波修復(fù)抗原;滴加正常山羊血清封閉液,室溫下反應(yīng)20 min;分別滴加濃度為1:200的兔抗大鼠Caspase-3單克隆抗體,濕盒中孵育過夜,PBS沖洗3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,37℃孵育30 min,滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC),濕盒中孵育20 min,DAB顯色,光鏡下控制顯色深度,脫水、透明、封片。以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。用圖像分析軟件,對(duì)每只大鼠腦相同間隔的3張切片,每張切片各測(cè)5個(gè)視野,在相同的放大倍數(shù)(400×)、視場(chǎng)面積和背景光強(qiáng)度下,分別對(duì)各組大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase-3陽性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。并運(yùn)用圖像分析軟件測(cè)量各個(gè)視野Caspase-3陽性細(xì)胞的光密度值,計(jì)算每張切片的平均光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),各組間的差別采用單因素方差分析進(jìn)行比較,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與正常組相比,AD模型組的平均逃避潛伏期時(shí)間顯著延長(zhǎng),撤除平臺(tái)后,AD模型組大鼠跨越原平臺(tái)的次數(shù)減少,兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);與模型組相比,電針組大鼠逃避潛伏期的時(shí)間明顯縮短,跨越原平臺(tái)的次數(shù)明顯增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),提示電針有改善AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的作用。詳見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

Hoechest33342染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常組大鼠海馬CA1區(qū)僅可觀察到極少量凋亡細(xì)胞,而Ab注射可顯著增加CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目,模型組與正常組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。電針組海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞的數(shù)目明顯降低,與模型組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。詳見圖1、表2。

圖1 各組大鼠Hoechest33342染色結(jié)果

表2 各組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 (±s,%)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.3 各組大鼠海馬Bcl-2和Bax表達(dá)比較

由表3可見,模型組大鼠海馬組織中Bcl-2蛋白表達(dá)相對(duì)值較正常組顯著降低(＜0.01);電針組大鼠海馬組織中Bcl-2蛋白表達(dá)相對(duì)值與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),提示電針治療可上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。模型組大鼠海馬組織中Bax蛋白表達(dá)相對(duì)值較正常組顯著增高(＜0.01);與模型組相比,電針組大鼠海馬組織中Bax蛋白表達(dá)相對(duì)值與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),提示電針組可下調(diào)Bax的表達(dá)。

表3 各組大鼠海馬Bcl-2和Bax表達(dá)比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.01

2.4 電針治療對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)的影響

Caspase-3陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要沉積在海馬CAl和CA3區(qū)錐體細(xì)胞層,呈棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒狀。由表4可見,模型組Caspase-3陽性細(xì)胞和平均光密度值與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。電針組Caspase-3陽性細(xì)胞和平均光密度值與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),提示電針組Caspase- 3陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值顯著降低。

表4 各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)及Caspase-3陽性產(chǎn)物平均光密度值比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

3 討論

中醫(yī)學(xué)對(duì)AD發(fā)病機(jī)理有著寶貴的經(jīng)驗(yàn)[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的發(fā)生與腎精虧虛、髓海失充有關(guān),故腎虛血瘀、神明失養(yǎng)是其基本病機(jī)。經(jīng)絡(luò)是構(gòu)成腦髓氣血津液運(yùn)行的通道,輸送精髓充實(shí)于腦,并為傳達(dá)腦神到人之五臟百骸之通路。根據(jù)“補(bǔ)腎通督、醒神益智”治療原則,結(jié)合經(jīng)絡(luò)理論《難經(jīng)·二十八難》:“督脈者……上至風(fēng)府,入屬于腦”,本實(shí)驗(yàn)選用督脈要穴百會(huì)和涌泉配伍治療,百會(huì)通督醒腦,涌泉為腎經(jīng)之根,兩穴合用,既可補(bǔ)腎益髓,又可活血化瘀、開竅醒神,起到貫通氣血、疏通督脈和補(bǔ)腎益髓的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床證明,中醫(yī)針灸具有較好地治療AD的作用[4]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),AD大鼠給電針治療后,在迷宮實(shí)驗(yàn)中,逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短,同時(shí)穿越原平臺(tái)次數(shù)明顯增加,表明電針可改善Ab1-40誘導(dǎo)的AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。

神經(jīng)元凋亡是造成AD神經(jīng)元丟失的主要途徑,同時(shí)也是引起進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能減退的根本原因。本研究發(fā)現(xiàn),在正常組,大鼠海馬CA1區(qū)僅可觀察到極少量凋亡細(xì)胞;而Ab注射可顯著增加CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目。電針治療可明顯降低海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞的數(shù)目;與模型組相比,電針組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少。本實(shí)驗(yàn)表明AD大鼠予以電針治療可能通過拮抗Ab的神經(jīng)毒性作用,保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗凋亡,進(jìn)而減輕AD的病理改變。

細(xì)胞凋亡不僅為機(jī)體維持正常生理所必需,而且與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。Bcl-2可抑制多種類型的細(xì)胞凋亡,促細(xì)胞生存。而Bax是與Bcl-2功能相拮抗的一個(gè)基因,可促進(jìn)凋亡發(fā)生。Bax和Bcl-2作為一個(gè)平衡體系,它們表達(dá)的比率在很大程度上影響著凋亡的發(fā)生[7]。研究表明,AD腦神經(jīng)元凋亡過程中Bcl-2家族扮演著重要角色。Ab處理可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,從而導(dǎo)致PC12細(xì)胞死亡。然而,轉(zhuǎn)染抗凋亡基因Bcl-2的PC12細(xì)胞抗損傷能力增強(qiáng),其機(jī)制可能與Bcl-2促使過氧化氫酶的表達(dá)和活化,有效清除自由基有關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn),Ab1-40海馬注射后,可誘導(dǎo)大鼠海馬結(jié)構(gòu)Bcl -2蛋白表達(dá)降低,Bax蛋白表達(dá)升高;同時(shí)電針治療組Bcl-2表達(dá)較模型組增高,而促凋亡蛋白Bax表達(dá)較模型組降低。因此,我們推測(cè)電針抑制Ab神經(jīng)毒性的機(jī)制可能與促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)和抑制Bax的表達(dá)有關(guān),電針通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2之間的平衡,減少神經(jīng)元凋亡和丟失。

細(xì)胞凋亡雖然受高度程序化調(diào)控,但是其最終都是通過凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3實(shí)現(xiàn)[9]。在正常狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)Caspase-3以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞漿。細(xì)胞凋亡時(shí)Caspase-3活化并且其表達(dá)隨著凋亡的不同階段發(fā)生重分布,在細(xì)胞凋亡的最后執(zhí)行階段,Caspase-3進(jìn)入細(xì)胞核,酶切細(xì)胞核內(nèi)下游底物,促使染色質(zhì)凝聚和核酶激活,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常組僅有少量的Caspase-3陽性神經(jīng)元,而模型組Caspase-3陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多,陽性反應(yīng)產(chǎn)物著色顯著加深,平均光密度值較對(duì)照組顯著增高。與AD模型組相比,電針組Caspase-3陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值顯著降低。結(jié)果表明電針治療可下調(diào)Caspase-3的表達(dá),從而抑制Ab誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,這可能是其抗細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的環(huán)節(jié)之一。

綜上所述,電針治療可通過上調(diào)海馬結(jié)構(gòu)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá),調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的平衡比值,降低凋亡執(zhí)行蛋白Caspase- 3的表達(dá)等環(huán)節(jié),對(duì)抗Ab誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,提高AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。本研究可為推廣電針治療AD以及闡明電針治療AD的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Mechanism of Action of Electroacupuncture in Improving Learning and Memory and Protecting Injured Hippocampal Neuron in Alzheimer’s Disease Rats

-,-,,-.

,,201203,

To investigate the mechanism of action of electroacupuncture in improving learning and memory and protecting injured hippocampal neuron in Alzheimer's disease (AD) rats.The rats were randomized into normal, sham operation, model and electroacupuncture groups. Spatial learning and memory were assessed using a Morris water maze. Change of learning and memory abilities was detected by Morris water maze. Apoptosis of hippocampal neurons was examined by hoechest 33342 staining. Bcl-2 and Bax levels were measured by Western blot analysis. The number and optical density value of Caspase-3-positive neurons were determined by Immunohistochemical staining.Electroacupuncture can significantly improve AD rat learning and memory function, and reduce the number of apoptotic cells in the hippocampal CA1 region, upregulate the expression of Bcl-2 and downregulate the expressions of Bax and apoptosis execution protein Caspase-3.Electroacupuncture can improve AD rat learning and memory function through regulating the balance ratio between Bax and Bcl-2, reducing Caspase-3 expression and counteractingb-amyloid protein-induced neuronal apoptosis.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Alzheimer’s disease; Rats

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.09.682

1005-0957(2012)09-0682-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102670);上海市教育委員會(huì)預(yù)算內(nèi)科研項(xiàng)目(2010JW03);上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50301)

國(guó)海東(1981 - ),男,助理研究員,博士

2012-05-30