駱 穎，張茂新，凌 冰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)生態(tài)研究室，廣州 510642)

苦瓜Momordica charantia別名涼瓜、錦荔枝、賴(lài)葡萄，為葫蘆科苦瓜屬一年生草本植物，作為一種蔬菜作物廣泛種植于非洲和亞洲，具有抗糖尿病，抑菌等功效 (Grover and Yadav，2004;Beloin et al.，2005;Maurya，2009)。與其他葫蘆科作物相比，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中很少被植食性昆蟲(chóng)為害 (Yasui et al.，1998;Abe and Matsuda，2000)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗蟲(chóng)性 (Kumar et al.，1979;Mishraetal，2006)。大量的研究結(jié)果表明，苦瓜葉片提取物對(duì)多種害蟲(chóng)有明顯的拒食、忌避產(chǎn)卵和抑制生長(zhǎng)發(fā)育的作用，并從中分離鑒定出多種對(duì)昆蟲(chóng)有生物活性的苦瓜素類(lèi)化合物，如Momordicin I、II、Ⅳ和 3β，7β，25-三羥葫蘆烷-5，23二烯-19-醛-3-O-β-D-吡喃葡糖苷等，這些化合物是一類(lèi)葫蘆烷型四環(huán)三萜類(lèi)植物次生物質(zhì)，對(duì)昆蟲(chóng)的作用方式主要是拒食、忌避產(chǎn)卵和抑制生長(zhǎng)發(fā)育 (Chandravadana et al.，1983;陳宏等，1996;李紹勤等，2001;Boeke，2004;Mekuria et al.，2005，2006;凌冰等，2008，2009;向亞林等，2009)。

我們前期的研究結(jié)果表明，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)有明顯的拒食和抑制生長(zhǎng)發(fā)育活性 (凌冰等，2008;向亞林等，2009)，對(duì)美洲斑潛蠅成蟲(chóng)的拒食和產(chǎn)卵忌避作用顯著 (凌冰等，2009)，對(duì)黃曲條跳甲也有明顯的拒食作用(楊舒媚等，2010)。駱?lè)f等 (另文發(fā)表)測(cè)定了苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)斜紋夜蛾實(shí)驗(yàn)種群增長(zhǎng)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育也有明顯的抑制作用。為了研究苦瓜葉乙酸乙酯萃取物及其活性化合物Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾的作用機(jī)理，我們測(cè)定了苦瓜葉片乙酸乙酯萃取物及其活性化合物Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸淀粉酶和蛋白酶活性的影響，旨在探索苦瓜植株的抗蟲(chóng)機(jī)理，為尋找新的昆蟲(chóng)拒食活性物質(zhì)，為合理利用苦瓜資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng)

斜紋夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院昆蟲(chóng)生態(tài)研究室在人工氣候室內(nèi) ［T:(27±1)℃;RH:70% ～80%;L∶D=14∶10］用人工飼料飼養(yǎng)的種群。斜紋夜蛾人工飼料參照陳其津等 (2000)的方法配制。

1.1.2 供試藥品

苦瓜葉乙酸乙酯萃取物及其活性化合物Momordicin II均由本課題組提供。其他試劑均為市售的化學(xué)純?cè)噭?，水由SZ－93自動(dòng)雙重純水蒸餾器制備 (上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和Momordicin II混合飼料的配制

用丙酮分別配置不同濃度的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和Momordicin II藥液。將配制好的尚未凝固的人工飼料分別定量地放入保鮮盒內(nèi)，按飼料:藥液等于5∶1的比例，將藥液加入人工飼料中，以丙酮作對(duì)照。待各濃度的含藥混合飼料中的溶劑自然揮發(fā)并凝固后，放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試蟲(chóng)處理及酶液的制備

將大小一致的頭一天蛻皮成4齡的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)饑餓4 h后，以不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和Momordicin II配制的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)，于處理后24 h、48 h和72 h，每處理挑取大小一致的試蟲(chóng)在冰浴下迅速解剖出中腸，去圍食膜及食物殘?jiān)?，將整個(gè)中腸轉(zhuǎn)移到5 mL的組織勻漿器中，加4 mL 0.02 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液，充分研磨后在4℃、4000 r/min條件下離心10 min，取上清液作酶液。

1.2.3 淀粉酶活性的測(cè)定

參考畢明娟等 (2010)的方法并略加改進(jìn)。取A、B兩支試管，在A管中加入0.2 mL酶液和0.8 mL 1%淀粉溶液作為底物，37℃水浴保溫15 min，再加入3，5－二硝基水楊酸試劑1.0 mL，沸水浴5 min，用蒸餾水定容至5 mL，然后用UV300紫外分光光度計(jì) (美國(guó)熱電公司)測(cè)定其在波長(zhǎng)520 nm處的吸光值。B管中加入0.8 mL磷酸緩沖液代替酶液，其余操作同A管。試驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)A、B管吸光值差計(jì)算比活力，以每分鐘每毫克蛋白催化水解生成1 mg麥芽糖為1個(gè)單位 (U)。

1.2.4 蛋白酶活性的測(cè)定

參考潘科等 (2010)的酪蛋白水解比色方法。取A、B兩支試管，在A管中先加入酶液1 mL，再加0.5%酪蛋白溶液2.0 mL，37℃水浴保溫15 min后加入3 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，以4000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定其在波長(zhǎng)680 nm處的吸光值。B管中加入1.0 mL磷酸緩沖液代替酶液，其余操作同A管，試驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)A、B管吸光值差計(jì)算比活力，以每分鐘每毫克蛋白催化水解生成1 μg酪氨酸為1個(gè)單位 (U)。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Bradford(1976)的考馬斯亮藍(lán)比色法。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

本文中，所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，方差分析采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法(Duncan's multiple range test，DMRT)。數(shù)據(jù)分析采用SAS system 9.0版軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸消化酶活性的影響

2.1.1 對(duì)淀粉酶活性的影響

以含有0.04%和0.08%濃度的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)，24 h、48 h和72 h后對(duì)中腸淀粉酶活力的影響見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，0.04%和0.08%2個(gè)濃度處理后24 h和48 h，斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸的淀粉酶活性與對(duì)照相比差異不顯著，但72 h后，各處理的淀粉酶活性明顯降低，0.04%和0.08%濃度的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物處理對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸淀粉酶活性的抑制率分別為22.7%和23.0%。

圖1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸淀粉酶活性的影響Fig.1 Effect of ethyl acetate extracts from Momordica charantia leaves on activities of amylase activities of larvae of Spodoptera litura

2.1.2 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)蛋白酶活性的影響

以含有0.04%和0.08%濃度的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)，24 h、48 h和72 h后對(duì)中腸蛋白酶酶活力的影響見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，0.08%濃度處理24 h后，斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸的蛋白酶活性就明顯低于對(duì)照組，抑制率達(dá)50.9%;48 h和72 h后，抑制率分別為38.4%和40.6%。0.04%濃度處理在24 h后對(duì)蛋白酶活性的影響與對(duì)照相比差異不顯著，但48 h和72 h后，對(duì)蛋白酶活性的抑制作用明顯增強(qiáng)，抑制率達(dá)38.9%和39.3%。說(shuō)明苦瓜葉乙酸乙酯提取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸的蛋白酶活性有明顯的影響。從上述結(jié)果可以看出，苦瓜葉乙酸乙酯提取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸蛋白酶活性的抑制作用大于對(duì)淀粉酶活性的抑制作用。

圖2 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸蛋白酶活性的影響Fig.2 Effect of ethyl acetate extracts from Momordica charantia leaves on activities of protease activities of larvae of Spodoptera litura

2.2 Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸消化酶活性的影響

2.2.1 Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸淀粉酶活性的影響

以含有 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.6%濃度的Momordicin II的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)，24 h、48 h和72 h后對(duì)中腸淀粉酶活力的影響見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，各濃度Momordicin II處理24 h、48 h和72 h后，斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸淀粉酶的活性與對(duì)照相比雖然有所降低但差異不顯著，表明Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸的淀粉酶活性無(wú)明顯的抑制作用。

2.2.2 Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸蛋白酶活性的影響

以含有 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.6%濃度的Momordicin II的人工飼料喂養(yǎng)斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)，24 h、48 h和72 h后對(duì)中腸蛋白酶活力的影響見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，MomordicinⅡ?qū)π奔y夜幼蟲(chóng)中腸的蛋白酶活力有明顯的影響，且隨著使用濃度的增加抑制作用也隨著增強(qiáng)。MomordicinⅡ處理24 h和48 h后，0.05%和0.10%濃度處理的蛋白酶活性與對(duì)照差異不顯著，而濃度為0.2%、0.4%和0.6%的Momordicin II處理24 h和48 h后，其蛋白酶活性均顯著低于對(duì)照，24h的抑制率分別為44.9%、53.1%和63.5%;48 h的抑制率分別為27.0%、31.9%和42.9%。處理72 h后，5個(gè)濃度處理蛋白酶活性均顯著低于對(duì)照，對(duì)蛋白酶活性抑制作用最強(qiáng)，各濃度處理的抑制率分別為 43.1%、40.2%、67.4%、71.8%和75.6%。說(shuō)明Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸的蛋白酶活性有顯著的抑制作用。

圖3 Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸淀粉酶活性的影響Fig.3 Effect of Momordicin II on activities of amylase activities of larvae of Spodoptera litura

圖4 Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸蛋白酶活性的影響Fig.4 Effect of Momordicin II on activities of protease activities of larvae of Spodoptera litura

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸淀粉酶活性和蛋白酶活性均有一定的抑制作用，且對(duì)蛋白酶活性的抑制作用更明顯。斜紋夜蛾幼蟲(chóng)取食了含有Momordicin II的人工飼料后，對(duì)蛋白酶活性的影響與苦瓜葉乙酸乙酯萃取物大體相同，但Momordicin II對(duì)淀粉酶活性的影響不明顯，說(shuō)明苦瓜葉乙酸乙酯萃取物中還存在抑制斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中腸淀粉酶活性的其他活性物質(zhì)。

近年來(lái)，大量的研究結(jié)果表明，苦瓜葉片萃取物及其次生化合物對(duì)多種害蟲(chóng)有明顯的拒食、忌避產(chǎn)卵和抑制生長(zhǎng)發(fā)育的作用 (Chandravadana et al.，1983，1987;陳宏等，1996;Yasui，1998;Abe etal.，2000;李 紹勤 等，2001;Boeke，2004;Mekuria et al.，2005，2006;Kashiwagi et al.，2007;任立云等，2008;凌冰等，2008，2009;向亞林等，2009)。目前已從苦瓜葉片提取物中分離鑒定出多種對(duì)昆蟲(chóng)有生物活性的苦瓜素類(lèi)化合物，它們是苦瓜抗蟲(chóng)的重要活性物質(zhì)，但有關(guān)這些化合物對(duì)昆蟲(chóng)的作用機(jī)理研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

MomordicinⅡ是苦瓜葉提取物中的最主要苦瓜素類(lèi)化合物，生物活性測(cè)定結(jié)果表明MomordicinⅡ具有拒食作用，拒產(chǎn)卵作用和抑制生長(zhǎng)發(fā)育的作用 (Yasui，1998;Mekuria et al.，2005;凌冰等，2008)。與楝科植物中的印楝素相同，均為四環(huán)三萜類(lèi)化合物。印楝素對(duì)多種害蟲(chóng)有拒食、觸殺、胃毒、抑制生長(zhǎng)發(fā)育和影響卵巢發(fā)育的作用(Schmutterer，1990)，通過(guò)影響口器上厭食及其他化學(xué)感器產(chǎn)生初生拒食反應(yīng);通過(guò)抑制昆蟲(chóng)中腸酯酶和脂肪體中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶和葡萄糖酶的活性，降低昆蟲(chóng)的取食率和對(duì)食物的轉(zhuǎn)化利用率形成次生拒食反應(yīng) (程?hào)|美等2007)。消化酶是由昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞形成和分泌的，其活性直接影響昆蟲(chóng)對(duì)食物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收。其中，淀粉酶和蛋白酶是昆蟲(chóng)最主要的消化酶?？喙先~乙酸乙酯萃取物和Momordicin II對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育及存活的影響可能與其抑制了幼蟲(chóng)中腸內(nèi)的消化酶有關(guān)，淀粉酶和蛋白酶活性的顯著降低直接影響了斜紋夜蛾幼蟲(chóng)對(duì)食物中淀粉、纖維素及蛋白質(zhì)等的消化和吸收，進(jìn)一步抑制了斜紋夜蛾幼蟲(chóng)對(duì)食物的攝取及維持其生理功能和生長(zhǎng)發(fā)育需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因而影響了斜紋夜蛾的正常生長(zhǎng)發(fā)育。

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