譚永安，肖留斌，孫 洋，季英華，柏立新

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南京 210014)

煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)為世界性、多寄主害蟲，不僅可以取食危害多種寄主植物，而且能夠傳播110多種植物病毒，給多種作物造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失 (Jones D，2003)。作為一個(gè)處于快速進(jìn)化過程的復(fù)合種，煙粉虱遺傳特性極為復(fù)雜，可分為多種不同的生物型，到目前為止，已經(jīng)命名的生物型至少有26個(gè) (Delatte Het al．，2005)。國(guó)內(nèi)研究結(jié)果表明:B型煙粉虱在我國(guó)廣泛分布 (羅晨等，2005);Q型煙粉虱自2005年首次在云南昆明發(fā)現(xiàn)以來 (褚棟等，2005)，隨后在江蘇、浙江、武漢等地區(qū)發(fā)現(xiàn)其危害 (徐婧等，2006;饒瓊等，2009;沈媛等，2011)，有報(bào)道表明Q型煙粉虱已在局部地區(qū)大量發(fā)生并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失 (徐婧等，2006);沈媛于2005～2009年對(duì)江蘇地區(qū)煙粉虱生物型演替進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱在江蘇地區(qū)發(fā)生頻率逐年升高，并由蘇中和蘇南地區(qū)向蘇北地區(qū)擴(kuò)散，顯示出逐漸取代 B型煙粉虱的趨勢(shì) (沈媛等，2011)。但是，由于不同生物型煙粉虱在寄主范圍、寄主危害程度均存在較大差異 (Nombela G et al．，2011;Bonato O et al．，2007)，因此，需進(jìn)一步研究明確不同生物型煙粉虱的地理分布特性與當(dāng)?shù)刂饕闹魑：Τ潭戎g的關(guān)系，明確重點(diǎn)防治作物與關(guān)鍵防治時(shí)期，以優(yōu)化區(qū)域性煙粉虱監(jiān)測(cè)防控策略。本研究在前人的工作基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步探討不同生物型煙粉虱在江蘇省不同農(nóng)區(qū)的發(fā)生現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)，明確江蘇省不同地域、主要受害作物上煙粉虱的生物型種類，探明不同生物型煙粉虱的地理分布與當(dāng)?shù)刂饕闹魃习l(fā)生程度及受害程度之間的關(guān)系。作者于2010年煙粉虱發(fā)生危害高峰期在江蘇省10個(gè)市、25個(gè)地點(diǎn)對(duì)當(dāng)?shù)刂饕芎闹魃蠠煼凼陌l(fā)生危害情況進(jìn)行了抽樣調(diào)查，應(yīng)用危害指數(shù)對(duì)不同作物上煙粉虱的發(fā)生危害程度進(jìn)行了比較，同時(shí)通過mtDNA COI分子標(biāo)記技術(shù)鑒定各地主要受害寄主上煙粉虱生物型，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以期從宏觀上進(jìn)一步把握不同生物型煙粉虱在江蘇省的區(qū)域性遺傳分布與主要寄主種類，從而指導(dǎo)防治。

1 材料與方法

1.1 寄主范圍及發(fā)生程度調(diào)查

于2010年煙粉虱發(fā)生高峰期，分別在江蘇省蘇南 (無錫、蘇州、南京)、蘇中 (南通、揚(yáng)州)和蘇北 (徐州、鹽城、宿遷、連云港、淮安)等多個(gè)地區(qū)調(diào)查主要寄主植物上煙粉虱的蟲口密度與危害情況。各地主要寄主植物上煙粉虱的蟲口密度與危害情況調(diào)查田塊均采用5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)調(diào)查5株，每株分別選上、中、下部葉片各2片，輕輕翻轉(zhuǎn)葉片，記錄成蟲數(shù)。同時(shí)采集葉片帶回實(shí)驗(yàn)室鏡檢，統(tǒng)計(jì)煙粉虱偽蛹、若蟲及卵的數(shù)量。對(duì)葉片密集且較難區(qū)分上、中、下部葉片的寄主植物，則分別取上部嫩葉和中下部老葉各3片作為鏡檢材料。對(duì)寄主植物上煙粉虱若蟲和偽蛹的數(shù)量以葉為單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，參照國(guó)內(nèi)外有關(guān)煙粉虱發(fā)生程度的標(biāo)準(zhǔn)，將其劃分為4個(gè)等級(jí):每葉小于10頭的為1級(jí)，記為“+”;10～30頭的為2級(jí)，記為“++”;30～50頭的為3級(jí)，記為“+++”;大于50頭的為4級(jí)，記為“++++”。

1.2 生物型鑒定

1.2.1 樣品采集

于2010年春、秋兩季在江蘇省13個(gè)地理區(qū)域采集煙粉虱成蟲。采樣時(shí)輕輕翻轉(zhuǎn)寄主葉片，用吸蟲管收集成蟲，成蟲放入75%的乙醇中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 煙粉虱總DNA提取

單頭煙粉虱成蟲經(jīng)ddH2O清洗后用濾紙吸干，參照羅晨等人的方法提取DNA(羅晨等，2002)。

1.2.3 煙粉虱COI基因的PCR擴(kuò)增

采用COI的通用引物C1－J－2195(5'－TTG ATT TTT TGG TCA TCC AGA AGT－3')和L2－N－3014(5'－TCC AAT GCA CTA ATC TGC CAT ATT A－3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)在eppendorf熱循環(huán)儀中進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系包含 DNA(20 ng/μL)3 μL，上游和下游引物 (10 μmol/L)各 1.5 μL，10 × Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，Taq(Takara)(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 15.5 μL。PCR 條件為95℃預(yù)變性5 min;95℃變性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次;最后72℃再延伸10 min。

PCR產(chǎn)物于1.0%(g/mL)的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè) (120 V，0.5×TBE)，溴化乙錠 (EB)染色后，在Bio－Rad Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.2.4 序列測(cè)定

在電泳中檢測(cè)到目標(biāo)片段后，用TianGenDNA純化試劑盒進(jìn)行回收純化，然后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，每采集點(diǎn)每種寄主上煙粉虱樣品分別測(cè)5頭。

1.2.5 序列分析

利用BLAST(NCBI網(wǎng)站)與國(guó)內(nèi)外代表地區(qū)的煙粉虱COⅠ序列進(jìn)行比對(duì)，通過Clustal X(序列相同時(shí)，則選取其中1條)和DNAstar軟件對(duì)DNA序列進(jìn)行比對(duì)及同源性分析，利用MEGA 5.1軟件對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建采用最大組成似然 (Maximum Composite Likelihood)模型，建立NJ(Neighbor－Joining)樹，各個(gè)分支的bootstrap置信度用1000次自導(dǎo)復(fù)制檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理種群煙粉虱樣本的生物型檢測(cè)及其系統(tǒng)發(fā)育分析

在蘇南、蘇中和蘇北不同生態(tài)區(qū)域，設(shè)置了25個(gè)采集樣點(diǎn)，共125個(gè)采集樣本，采用mtDNACOI分子標(biāo)記技術(shù)鑒定江蘇不同地理種群煙粉虱的Q、B生物型，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。所有樣品測(cè)序均得到800 bp以上的片段 (圖1)，分別從每個(gè)所測(cè)序列中截取720 bp的序列進(jìn)行分析。通過分子生物學(xué)分析軟件DNAMAN結(jié)合基因庫(kù)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在所檢測(cè)的125個(gè)煙粉虱種群COI基因序列中有118個(gè)相同 (序列編號(hào)為QJiangsu，簡(jiǎn)稱Q－JS)，其余7個(gè)COI基因序列一致 (序列編號(hào):B－Jiangsu，簡(jiǎn)稱 B－JS)。與已知序列比較 (表1)，以溫室白粉虱為外群，建立NJ樹 (圖2)。由構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看到，本試驗(yàn)所檢測(cè)到的Q－JS與B－JS兩個(gè)種群的煙粉虱與溫室白粉虱的遺傳距離較大，首先與溫室白粉虱區(qū)別開來。Q－JS序列與已知Q型煙粉虱序列Q－Zhejiang、Q－USA和Q－Japan的同源性高達(dá)100%，顯示Q－JS與已知的Q型煙粉虱種群聚為同一進(jìn)化枝;B－JS與已知B型煙粉虱序列BPakistan、B－Japan、B－Beijing的同源性為100%，表明B－JS與已知的B型煙粉虱種群聚為同一進(jìn)化枝。上述序列比對(duì)與同源性分析結(jié)果表明，江蘇不同地理種群煙粉虱Q、B生物型同時(shí)存在。

圖1 煙粉虱部分樣品mtCOI DNA基因片段的PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 PCR products of mtCOI DNA M，分子量參照;1－10，煙粉虱樣品;M，Marker;1－10，Bemisia tabaci samples．

圖2 基于COI基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of B.tabaci populations based on COI sequences

表1 系統(tǒng)進(jìn)化分析中引用的其他序列信息Table 1 COI sequences cited in this paper

2.2 不同生物型煙粉虱地理分布及主要寄主危害程度

為全面探究江蘇不同生態(tài)農(nóng)區(qū)煙粉虱的生物型分布與主要寄主受害之間的關(guān)系，2010年我們?cè)谔K南、蘇中和蘇北不同生態(tài)區(qū)域的25個(gè)采集樣點(diǎn)中涉及了18種主要寄主作物，結(jié)合上述生物型檢測(cè)結(jié)果，分析江蘇不同地理種群煙粉虱的Q、B生物型分布及在主要寄主作物上的發(fā)生危害程度(表2)。序列分析檢測(cè)結(jié)果表明，在所有的采集點(diǎn)與寄主作物上均檢測(cè)到Q型煙粉虱。Q型煙粉虱的樣點(diǎn)檢出率為100%，但從樣本的角度看，蘇南、蘇中和蘇北的樣本數(shù)分別為40、25、60，其Q型煙粉虱相應(yīng)的樣本檢出率分別是97.50%、96.00%和91.67%。全省的Q型煙粉虱樣本檢出率為94.40%。從采集寄主上看，Q型煙粉虱在18個(gè)寄主上都發(fā)生為害，其中在茄科、葫蘆科、錦葵科等經(jīng)濟(jì)作物上發(fā)生與危害程度最重，在十字花科、豆科作物上發(fā)生為害較輕，在菊科與莧科作物上發(fā)生危害最輕。僅在6個(gè)采集點(diǎn)、4種寄主、7個(gè)樣本上檢測(cè)到B型煙粉虱，樣本檢出率為5.6%。從表1可看出，Q型煙粉虱已成為江蘇地區(qū)的優(yōu)勢(shì)生物型，在番茄、黃瓜、茄子、棉花、辣椒等經(jīng)濟(jì)作物上蟲口密度大，植株受害重，應(yīng)重視這類寄主作物上Q型煙粉虱的監(jiān)測(cè)與防控。

表2 江蘇不同地理種群煙粉虱的生物型分布與主要寄主發(fā)生危害程度Table 2 The distribution of the different biotype and occurrence level of B.tabaci in main host crops in Jiangsu

3 結(jié)論與討論

煙粉虱在世界范圍廣泛分布、寄主植物多樣化，生物型和地理分化明顯。因此，煙粉虱生物型的監(jiān)測(cè)與鑒定工作既是煙粉虱綜合治理的基礎(chǔ)，也直接影響到煙粉虱防控策略的優(yōu)化。已有研究發(fā)現(xiàn)本世紀(jì)初煙粉虱在我國(guó)的傳播以B型煙粉虱取代白粉虱和當(dāng)?shù)責(zé)煼凼瓰橹饕厔?shì) (吳杏霞，2002;臧連生，2005;幐希，2009)，此后Q型逐步取代B型，并在我國(guó)大部分地區(qū)成為優(yōu)勢(shì)生物型 (徐婧等，2006;饒瓊等，2009)。另外在多個(gè)地區(qū)也發(fā)現(xiàn)非B、Q生物型的存在，如在廣西南寧的南瓜寄主上發(fā)現(xiàn)非B型煙粉虱 (廣西型)(邱寶利等，2003);在山東、河北和浙江發(fā)現(xiàn)2個(gè)非B/Q型 (褚棟等，2005)，其中浙江非B/Q型可能是中國(guó)本地種 (臧連生等，2005)。在江蘇省，沈媛等從2005～2009年對(duì)江蘇省煙粉虱生物型進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)B型和Q型煙粉虱都有分布，同時(shí)Q型煙粉虱有從江蘇的蘇南和蘇中向蘇北擴(kuò)散的趨勢(shì)，2009年Q型煙粉虱在蘇北的發(fā)生分布頻率由2005年的 47.42%上升為 77.78% (沈媛等，2011)。2010年我們采集了江蘇省絕大部分地區(qū)煙粉虱種群，涉及18種主要寄主，包括棉花、蔬菜和花卉等，其結(jié)果可進(jìn)一步充實(shí)不同生物型煙粉虱在江蘇地區(qū)的遺傳分布特性。根據(jù)mtDNA COI基因序列分析結(jié)果，Q型煙粉虱在江蘇省為主要生物型煙粉虱，占所測(cè)總樣本94.40%。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果還表明，Q型煙粉虱在蘇南、蘇中和蘇北的比例相差不大，均大于90%，其比例高于沈媛等2009年的檢測(cè)結(jié)果，說明Q型煙粉虱從蘇南、蘇中擴(kuò)散到蘇北的頻率在進(jìn)一步加快，并有取代B型煙粉虱的趨勢(shì)。Q型煙粉虱的競(jìng)爭(zhēng)取代機(jī)制是否也存在非對(duì)稱互作交配現(xiàn)象尚需進(jìn)一步研究(Liu et al．，2007)。

通過系統(tǒng)聚類樹分析發(fā)現(xiàn)，江蘇地區(qū)的Q型煙粉虱與我國(guó)浙江、美國(guó)和日本的Q型煙粉虱聚為一枝，B型煙粉虱與巴基斯坦、日本和我國(guó)北京的B型煙粉虱聚為一枝。從對(duì)江蘇地區(qū)煙粉虱的寄主危害程度的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，Q型煙粉虱在葫蘆科、茄科、錦葵科等寄主植物上蟲量較高，危害也較重，已經(jīng)成為危害蔬菜、棉花等安全生產(chǎn)的重要致災(zāi)因子。特別是由于設(shè)施農(nóng)業(yè)在江蘇省大范圍推廣，有利于Q型煙粉虱危害的寄主、越冬的場(chǎng)所逐年增加，同時(shí)Q型煙粉虱對(duì)多種新型煙堿類殺蟲劑的抗藥性高于B型煙粉虱 (Rauch N and Nauen R，2003)，因此亟待加強(qiáng)設(shè)施農(nóng)業(yè)中Q型煙粉虱的防控。

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