陳宗艷，李傳峰，高景鵬，朱英奇，王玢瑸，楊宗偉，劉光清

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）能引起雛鵝發(fā)生一種急性或亞急性的敗血性傳染病，以急性腸炎以及心、肝、腎等實質(zhì)臟器發(fā)生炎癥為主要特征，病死率較高，俗稱“小鵝瘟”[1,2]。GPV為細(xì)小病毒科依賴病毒屬成員，基因組為單股線性DNA，由5106個核苷酸組成，含有2個主要開放閱讀框架（open reading frame, ORF）[3,4]。ORF1編碼2個非結(jié)構(gòu)蛋白：Rep1和Rep2，ORF2編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白：VP1、VP2、VP3。其中，VP2基因全長1764 bp，是組成GPV衣殼的主要成分，可以自我裝配成病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）[5,6]。此外，研究表明，VP2內(nèi)含有病毒的主要抗原決定簇，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，同時也是中和抗體作用的靶蛋白[7]。

由于GPV具有嚴(yán)格的種屬特異性，無合適的傳代細(xì)胞系培養(yǎng)。因此，不能用傳統(tǒng)方法研制其細(xì)胞滅活疫苗。通過禽胚連續(xù)傳代方法，致弱GPV以研制的弱毒疫苗則存在毒力返強(qiáng)的潛在風(fēng)險，同時生產(chǎn)成本也偏高，加之種鵝和雛鵝所用疫苗不同，大大限制了此類疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，研制新型GPV疫苗已成為必然趨勢[8,9]。大量研究證明，VLPs在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，可以模擬成熟病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫；此外，由于VLPs不含有核酸，在體內(nèi)無引發(fā)感染和發(fā)生病毒基因與宿主染色體基因整合等優(yōu)點，因此，以之作為預(yù)防性疫苗非常安全，具有較好的應(yīng)用前景[6,10]。本研究即根據(jù)GPV VP2蛋白可以自我組裝成VLPs的特性，利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)GPV的病毒樣顆粒。同時，為了提高VLPs的表達(dá)量，我們還對VP2的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，并鑒定了所表達(dá)的蛋白。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin及Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Invitrogen 公司；pMD18-T 載體、Primer star聚合酶、限制性內(nèi)切酶、PCR 引物均為大連TaKaRa 公司產(chǎn)品；鼠抗鵝細(xì)小病毒GPV VP2抗體由本實驗室制備；ECL Western blot Substrate試劑盒購自Thermo scientific公司；山羊抗小鼠IgG購自北京中衫金橋公司。

1.2 VP2 基因的克隆 根據(jù)GenBank (登錄號：JF333590)中的GPV VP2 基因序列設(shè)計引物，并在引物兩端分別加上EcoRⅠ及Hind Ⅲ酶切位點。運用常規(guī)PCR方法，使用Primer star聚合酶擴(kuò)增VP2 基因，然后克隆至pMD18-T載體中，獲得重組質(zhì)粒pMD-rVP2，將其送至上?；蛏锛夹g(shù)公司進(jìn)行測序鑒定。

根據(jù)昆蟲細(xì)胞對密碼子的偏嗜性，對GPV VP2基因進(jìn)行優(yōu)化，然后將密碼子優(yōu)化的VP2基因送交南京金斯特生物工程公司合成，并克隆至pMD18-T載體，獲得重組質(zhì)粒pMD-mVP2。

1.3 重組桿狀病毒表達(dá)載體Bac-VP2的構(gòu)建 首先，使用EcoRⅠ 、Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒pMD-rVP2和pMD-mVP2，然后將釋放出的VP2 基因插入pFastBac1質(zhì)粒載體中，分別得到重組質(zhì)粒pFast-rVP2 和 pFast-mVP2。 再 將 pFast-rVP2 和pFast-mVP2分別轉(zhuǎn)化含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的E. coli DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，通過與Bacmid發(fā)生位點特異性轉(zhuǎn)座，獲得兩種重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒Bacmid-rVP2和Bacmid-mVP2。采用PCR 方法對上述重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為4064 bp。 引 物 序 列：M13F：5'-gttttcccagtcacgac-3'，M13R：5'-caggaaacagctatgac-3'。擴(kuò)增條件： 93℃預(yù)變性 3 min； 94℃ 變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 5 min，共30個循環(huán)；72℃ 延伸7 min。

1.4 重組桿狀病毒rBac-VP2 的制備及病毒滴度測定 按照Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)說明書，將鑒定正確且純化除菌的Bac-rVP2和Bac-mVP2分別用轉(zhuǎn)染試劑（Cellfectin）轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf9 細(xì)胞，27℃培養(yǎng)5 d，待出現(xiàn)典型致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect ，CPE）時收獲第1 代重組桿狀病毒，分別命名為Bac-rVP2、Bac-mVP2。隨后，再用收獲的第1代病毒感染Sf9 細(xì)胞，擴(kuò)增并獲得高滴度的第2 代重組病毒。用終點稀釋法測定重組病毒的滴度，具體程序：將rBac-rVP2和rBac-mVP2分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，感染96 孔板Sf9 細(xì)胞，27 ℃ 培養(yǎng)5 d 后，在顯微鏡下觀察并記錄發(fā)生CPE 的孔數(shù)，對于臨界稀釋倍數(shù)的所有孔(該稀釋倍數(shù)病毒感染孔中有部分孔發(fā)生CPE)用免疫熒光法檢測VP2 的表達(dá)（參見1.5），以進(jìn)一步確定有發(fā)生病毒復(fù)制的孔數(shù)，利用下列公式來計算病毒滴度:

[病毒復(fù)制孔數(shù)/（該稀釋度總孔數(shù)×單孔病毒液體積）]×稀釋倍數(shù)。

1.5 VP2 在Sf9 細(xì)胞中的表達(dá)與檢測 分別用第2代rBac-rVP2和rBac-mVP2以10倍感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI)）接種2份Sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)72 h后，一份用于SDS-PAGE 及Western blot檢測，另一份用于IFA檢測。IFA試驗過程如下：Sf9細(xì)胞去除上清后，加入冷固定液 （甲醇與丙酮1:1混合，-20℃保存）固定15 min，吸去固定液，用含1% BSA的PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；加入稀釋的鼠抗VP2 蛋白抗體（1:200稀釋）37℃孵育1 h，漂洗3次，每次5 min；加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG （1:100稀釋），37℃孵育1 h，漂洗3次后于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 GPV VLPs 的純化及電子顯微鏡鑒定 10 MOI Bac-mVP2感染Sf9 3～4 d，待細(xì)胞病變明顯，收集細(xì)胞；超聲破碎后，于15 000×g 離心10 min，除去細(xì)胞碎片；將上清轉(zhuǎn)移至鋪有蔗糖（40%，W/W；TNE配制）墊層的離心管中，于4 ℃、45 000 ×g （SW32 Ti 轉(zhuǎn)子，Beckman）離心3 h。超離后的沉淀用TNE緩沖液重懸，接著使用非連續(xù)CsCl 梯度（1.15、1.20、1.25 g/mL；TNE配制）于4 ℃、160 000× g（SW41 Ti 轉(zhuǎn)子，Beckman）離心15 h。分管收集白色致密條帶，用TNE稀釋后，再次于4 ℃、45 000× g （SW32 Ti 轉(zhuǎn)子，Beckman）離心3 h除鹽，溶解沉淀，使用磷鎢酸負(fù)染，于透射電鏡下觀察VLPs。

2 結(jié)果

圖1 密碼子優(yōu)化前后的基因序列Fig.1 The sequences of the original and codon-optimized VP2 genes

2.1 攜帶VP2 基因重組桿狀病毒的制備 用常規(guī)PCR方法成功擴(kuò)增出VP2基因，其長度為1776 bp。酶切鑒定與測序結(jié)果均證明擴(kuò)增的VP2基因與參考序列一致，其氨基酸同源性為100%。將VP2基因及密碼子優(yōu)化的VP2基因（圖1）分別亞克隆至pFastBac1中，成功獲得pFast-rVP2和pFastmVP2。用此兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，獲到Bac-rVP2和Bac-mVP2兩種重組質(zhì)粒。由于桿狀病毒載體的基因組較大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過靶基因的長度 (1764 bp)，因此，不便于利用限制性內(nèi)切酶酶切的方法進(jìn)行鑒定，在此，我們采用了說明書推薦的PCR 方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。檢測結(jié)果表明，成功獲得了攜帶VP2基因的重組桿狀病毒（圖2）。Bac-rVP2轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞獲得的第1 代重組桿狀病毒Bac-rVP2感染Sf9 細(xì)胞后，得到第2代 Bac-rVP2，滴度為 3.5×107； Bac-mVP2轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得的第2代毒的滴度為8.5×107。將第2代Bac-rVP2、Bac-mVP2保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 GPV VP2 蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá) 10 MOI Bac-rVP2及Bac-mVP2感染Sf9 3～4 d后，用IFA法可檢測到VP2在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。如圖3所示，Bac-rVP2及Bac-mVP2 感染的Sf9細(xì)胞均出現(xiàn)特異的綠色熒光(圖3a、3b)，而對照的Sf9細(xì)胞中未見熒光(圖3c)。

圖2 PCR法檢測Bac-rVP2和Bac-mVP2結(jié)果Fig.2 PCR results of Bac-rVP2 and Bac-mVP2

圖3 IFA法檢測GPV VP2蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Detection GPV VP2 proteins expressed in Sf9 cells by IFA

將收獲的重組病毒進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測結(jié)果顯示野生型VP2和密碼子優(yōu)化的VP2（mVP2）都得到了成功表達(dá)，其分子量均約為65 kDa (圖4a)。Western blot檢測結(jié)果則證明表達(dá)的VLPs不僅特異而且具有良好免疫原性 (圖4b)。此外，根據(jù)SDS-PAGE電泳及蛋白免疫電泳結(jié)果也可推知，VP2的密碼子優(yōu)化后，其在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)量獲得了顯著提高。

2.3 VLPs 的電鏡觀察 Bac-mVP2 感染Sf9 所收集的細(xì)胞，經(jīng)離心純化、負(fù)染，電鏡觀察，可見VLPs，背景清晰（圖5）。

3 討論

圖4 rBac-rVP2及rBac-mVP2在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白的SDS-PAGE(a)及Western blot(b)檢測結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE(a)and Western blot(b)analysis of Sf9 cell extracts expressing VP2 protein using a polyclonal anti-GPV mouse serum

由于GPV具有嚴(yán)格的種屬特異性，目前尚無合適的增殖GPV的傳代細(xì)胞系，因此, 通過體外培養(yǎng)方式獲得GPV很困難，而制備相應(yīng)的診斷抗原或有效新型疫苗的候選抗原，也只能憑借基因工程手段獲得。研究表明，VP2是GPV最重要的免疫原基因，無論是在診斷和抗病毒感染方面都具有較大的開發(fā)潛力。所以大量獲得具有良好免疫原性的VP2蛋白在GPV基礎(chǔ)與應(yīng)用研究方面都具有重要意義[7]。目前，用來生產(chǎn)VP2 蛋白的表達(dá)系統(tǒng)主要是原核表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，前者雖然能大量表達(dá)VP2蛋白，但VP2自聚成VLPs的能力喪失，而且由于缺乏必要的翻譯后修飾，重組蛋白的抗原性不如天然抗原優(yōu)越，因此用原核細(xì)胞表達(dá)VP2蛋白具有一定的局限性。相比之下，以Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng)為代表的桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系則具有與動物細(xì)胞類似的轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后加工等優(yōu)勢，使得表達(dá)產(chǎn)物能擁有接近天然蛋白的生物學(xué)活性[5,6]。因此，該系統(tǒng)被廣泛用于外源蛋白的表達(dá)，并逐漸發(fā)展為成熟的商品化的真核表達(dá)系統(tǒng)。

圖5 電子顯微鏡觀察mVP2形成的VLPs（53 000×）Fig.5 Electron micrographs of GPV VLPs derived from mVP2 (53 000×)

Ghislaine等[5]首次利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了GPV VP2蛋白，并獲得了具有良好免疫原性的VLPs，但其不足之處是蛋白的表達(dá)量偏低，限制了該抗原的擴(kuò)大生產(chǎn)。我國是水禽養(yǎng)殖業(yè)大國，GPV感染對我國的水禽養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了較大威脅[11]，無論是快速診斷GPV感染，還是預(yù)防GPV疫情，都需要大量制備具有良好免疫原性的GPV抗原。為適應(yīng)這一生產(chǎn)需要，根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子的偏嗜性，我們嘗試通過優(yōu)化GPV VP2密碼子的方法，以改變tRNA作用強(qiáng)度增加合成基因的表達(dá)量[12]，克服天然VP2蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)量偏低的局限性。通過比較昆蟲細(xì)胞及GPV的密碼子使用頻率表，發(fā)現(xiàn)其中編碼Ala、Asp、Leu、Lys、Val氨基酸的密碼子使用頻率差異超過13次以上，我們推測由于GPV基因密碼子的偏嗜性與所選表達(dá)宿主細(xì)胞的tRNA含量不匹配，可能是導(dǎo)致GPV VP2在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)受到限制的原因。據(jù)此，我們在不改變GPV VP2氨基酸序列的前提下，將其密碼子替換為昆蟲細(xì)胞偏嗜的密碼子，并根據(jù)影響表達(dá)的其他因素作個別位點調(diào)整，如降低VP2的GC含量，消除VP2編碼區(qū)內(nèi)可能導(dǎo)致翻譯提前終止的潛在加尾信號（AT富含區(qū)）等抑制元件[13]。

本研究結(jié)果證實，在不改變VP2氨基酸序列的前提下，通過優(yōu)化VP2密碼子途徑以提高其在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)量是可行的。雖然，我們沒有對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，但是根據(jù)SDS-PAGE電泳和Western blot檢測結(jié)果，仍能判斷密碼子優(yōu)化的VP2的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型VP2的表達(dá)。此外，間接免疫熒光檢測和蛋白免疫電泳試驗結(jié)果也顯示，本研究表達(dá)的VP2蛋白具有良好的免疫原性。更重要的是，通過電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)密碼子優(yōu)化的VP2 蛋白能夠在昆蟲細(xì)胞中自行裝配成VLPs，其直徑為20～30 nm，形狀大小與全病毒粒子相似。這說明密碼子的優(yōu)化不僅不影響VP2的折疊功能，而且可以顯著提高其表達(dá)量。

綜上所述，本研究通過優(yōu)化GPV VP2密碼子，實現(xiàn)了VP2蛋白在昆蟲細(xì)胞的大量表達(dá)，并成功獲得了具有良好免疫原性的密碼子優(yōu)化型VLPs，為進(jìn)一步建立檢測GPV感染的血清學(xué)方法以及研制有效的基因工程疫苗等奠定了良好基礎(chǔ)。

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